1质粒DNA的提取.ppt

实验一 质粒DNA的提取 目的与要求 通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA， 了解用分光光度计测定DNA含量的方法。 质粒 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。 载体 用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。 具备的条件： 易于鉴定； 在受体细胞中可以独立复制； 易于筛选； 易于导入受体细胞。 质粒结构 抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene) 启始复制子（ori, Origin of replication)； 多克隆位点(MSC, Multiple cloning site or polylinker)； 标记基因(Marker gene, such as LacZ gene)。 实验原理 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 仪器、材料与试剂 [仪器 恒温培养箱 恒温摇床 台式离心机 高压灭菌锅 材料 1.葡萄糖 2.三羟甲基氨基甲烷（Tris） 3.乙二胺四乙酸（EDTA） 4.氢氧化钠 5.十二烷基硫酸钠（SDS） 6.乙酸钾 7.冰乙酸 8.乙醇 9.盐酸（HCl） 10.Bt菌株 11.吸头、小指管 试剂 溶液I 50mmol/L 葡萄糖 5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl 10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0） 溶液II 0.4mol/L NaOH , 2% SDS ,用前等体积混合 溶液III 5mol/L乙酸钾 60mL 冰乙酸 11.5mL 水 28.5mL TE缓冲液 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA(pH8.0) 70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回） 离心，10000r/min，7min，上清移入另一干净离心管，并加1ml 100％乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液; 沉淀用70％乙醇清洗一次，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥; 加入30-50?l灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提); 将分离出的质粒DNA置于-20℃保存备用。 注意： 用移液器（俗称“枪”）操作时，每一步都要格外小心，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA); 加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，避免导致基因组DNA的断裂而污染质粒DNA！！！ 实验报告 目的与要求 实验原理 材料与方法 结果与讨论 * 将实验菌株按1：100接种于新鲜的LB液体培养基 37℃振荡培养过夜 取1.5ml培养物 离心收集菌体 弃去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥 实验步骤 细菌沉淀 + 100μL solution I 是一种等渗缓冲溶液，内含葡萄糖以降低剪切力 剧烈振荡 加200μL溶液II（新鲜配制） 裂解细胞，强碱溶液中质粒和染色体DNA变性 快速颠倒5次（轻柔） 冰上放置5min 加150μL溶液Ш 中和质粒DNA复性 冰上放置5－10min 颠倒6-7次混匀 *