基因工程实验指导书【参考】.docVIP

目 录 实验一、质粒DNA的提取 实验二、细菌基因组的提取 实验三 DNA的限制性内切酶解及电泳、PCR电泳 实验一、质粒DNA的提取 质粒是一种双链的共价闭合环状的DNA分子,是细胞染色体外能够稳定遗传的因子。在基因克隆的实验中,要把一个有用的外源基因通过重组DNA技术,送进生物细胞中去繁殖和表达。实现携带外源基因进入受体细胞的工具被称为载体,细菌质粒是基因工程中常用的载体之一。作为基因工程的载体需具备下列条件:（1）是一个复制子,载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖;(2)载体在受体细胞中能大量增殖,只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；3)载体DNA链上有一至数个限制性内切酶的单一识别与切割位点,便于外源基因的插入;(4)载体具有选择的遗传标记,如抗氨苄青霉素基因(AmpR,抗新霉素基因(NeoR)等,以此判断载体是否进入受体细胞,并据此将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来. 细菌质粒在细胞内的复制,一般分为两种类型:严密控制型和松驰控制型。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,与染色体复制相关联,每个细胞只含有一个或几个质粒分子,如ColEI质粒(含有产生大肠杆菌毒素EI基因),pBR322就是ColEI衍生的质粒。后者在整个细胞周期中随时可以复制,具多拷贝,一般在120个以上。本实验分离纯化的质粒为pQE30,为高拷贝质粒。 通过本实验学习了解质粒DNA的特点,掌握碱性SDS快速法从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒DNA. 一、实验原理 所有分离质粒DNA的方法都含有以下3个步骤:①细菌培养物的生长;②细菌的收获和裂解;③质粒DNA的纯化。 本实验以碱性SDS快速法小量制备pQE30质粒。碱裂解法对于以前应用的所有的大肠杆菌均卓有成效。该方法的特点是,加溶菌酶可破坏菌体细胞壁(小量制备可省略不用溶菌酶),去污剂SDS可使细胞壁裂解,并使蛋白质变性,在碱性条件下,破坏碱基配对,故可使宿主的线状染色体DNA变性,但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。当条件恢复正常时(加入酸性试剂中和),质粒DNA链迅速得到准确配置,重新形成完全天然的超螺旋分子。细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上,离心时易被沉淀下来而质粒DNA则留在上清液中,乙醇沉淀后可得到质粒DNA.如需进一步纯化,可应用聚乙二醇沉淀法或氯化铯一溴化乙锭梯度平衡法。 环状双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型:当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时,称之为共价闭合环状DNA(CCCDNA),这样的DNA通常呈现超螺旋SC构型;如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构,另一条出现有一至数个缺口时,称之为开环DNA(OCDNA),此即OC构型;若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后,发生双链断裂而形成线性分子(LDNA),通称L构型。质粒DNAMr一般在106～107之间,常以kb表示(lkb双链DNA=6.6×105),如质粒pUC19的Mr为1.8×106(2.69kb)。在琼脂糖凝胶电泳中,不同构型的同一种质粒DNA,尽管M相同,仍具有不同的电泳迁移率,其中走在最前沿的是scDNA,其后依次为LDNA和ocDNA。 二 仪器、材料与试剂 (一)仪器 恒温培养箱 恒温摇床 台式离心机 高压灭菌锅 (二)材料 1.葡萄糖 2.三羟甲基氨基甲烷(Tris) 3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.氢氧化钠 5.十二烷基硫酸钠(SDS) 6.乙酸钾 7.冰乙酸 8.氯仿 9.乙醇 10.RNA酶 11.氨苄青霉素 12.蔗糖 13.溴酚蓝 14.酚 15. 8一羟基喹琳 16. β一巯基乙醇 17.盐酸(HCl) 18.含pUC19质粒的大肠杆菌 19.吸头、小指管 (三)试剂 1.溶液I 50 mmol/L 葡萄糖 5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris-HCL(pH8.0) 10 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0) 2.溶液II 0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混合 3.溶液III 5mol/L乙酸钾 60 mL 冰乙酸 11.5 mL 水 28.5 mL 4.TE缓冲液 l0 mmol/L Tris-HCI 1 mmol/L EDTA(pH8.0) 5 70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回) 6.、膜RNA酶 将RNA酶溶于10mmol/LTris-HCI(pH7.5)、15mmol/LNaCL中,配成10mg/mL的浓度,于100℃加热15min,缓慢冷却至室温,保存于-20℃。 7.:40%蔗糖、0.25%溴酚兰