一例规模猪场正常分娩产死胎增加的病原诊断报告.docVIP

一例规模猪场母猪正常分娩而死胎增加的病原诊断报告 夏 伟1，张宇辉1，马迪杨1，危艳武2，刘长明2 （1.哈尔滨维科生物技术开发公司，黑龙江 哈尔滨 150069；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪传染病研究室，黑龙江 哈尔滨 150001） 吉林省某规模猪场母猪存栏500多头，2012年8月份向笔者反映猪场最近3个月以来经常出现正常分娩的母猪产仔死胎比例增加的现象，母猪未见任何异常症状，而且死亡的胎儿新鲜，体重较大，未见木乃伊化以及畸形；剖检时发现死亡胎儿肺脏充血、出血、水肿、间质增宽；肾脏肿大,充血，脐带出血等病理变化。为了确诊该猪场母猪产仔死胎增加的病因，我们应用PCR,RT-PCR方法对常见的能够引起母猪繁殖障碍的猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、细小病毒(PPV)、日本乙型脑炎病毒（JEV)进行了检测，结果确诊猪繁殖与呼吸综合征变异毒株(HPPRRSV)，俗称高致病蓝耳病病毒是引起本场母猪产死胎增加的主要原因，关于高致病蓝耳病病毒(HP-PRRSV)引起猪群母猪流产风暴和高热性疾病的报道很多，但正常分娩而死胎增加为特征的病例报道较少，临床上发病率较高而没有引起普遍重视。因此本报告对高致病蓝耳病病毒引起猪场群发性、持续性产死胎的临床诊断具有重要的借鉴意义，我们将有关诊断报告如下。 1 材料与方法 1.1 病料来源 采自吉林长春市某猪场死胎病料3头（肺、腹淋、脾），剖杀断奶消瘦仔猪2头（脾、淋巴结）。编号后冷冻运送，-20 ℃保存备用。 1.2 酶和其他试剂 PCR和RT-PCR扩增试剂盒、饱和酚、Taq DNA聚合酶、dNTPs、EB、DEPC水、TRIZOL(总RNA抽提试剂主要成分苯酚等）、DL 2000 Marker、TaKaRa RNA PCRKit（AMV）Ver.3.0 均购自宝生物工程（大连）有限公司。 1.3 引物设计与合成 根据 GenBank 发表的 PRRSV（猪繁殖与呼吸综合征病毒）、CSFV（猪瘟病毒）、PCV2（圆环病毒2型）、PRV(伪狂犬病毒)、PPV（猪细小病毒）、JEV（猪乙型脑炎病毒）.用 Oligo6.0 软件设计引物，扩增PRRSV的上游引物：5′-ACCATGGAGGAGGATCTGCTAAAAC-3′；5′-CTGGTAAGCAGACGTGTTGCG-3′，扩增缺失株（高致病性PRRSV毒株） bp；扩增PCV2的上游引物：5′-CAGCAAGAAGAATGGAAGAAGCGGA-3′，下游引物：5′-CCAGGACTACAATATCCGTGTAACT-3′，扩增目的片段长度为1 057 bp扩增CSFV的上游引物CSFV-F：5′-CCTGACGCCACGATT-3′，下游引物CSFV-R：5′-GGGGACTCC（G） TTGCATATTTTT（T）-3′，扩增目的片段长度为603 bp；扩增PRV的上游引物 gEl：5-CCGCGGGCCGTGTTCTTTGT-3’和下游引物gE2：5-CGTGGCCGTTGTGGGTCAT-3扩增493 bp[1]；扩增PPV的上游引物P1：5-CGACGAAGCCTACGACAAATAC-3和P2：5-TGCTGGTAGTGTTCCTGG GTG-3扩增vp2基因的目的片段长1 255 bp。扩增JEV的上游引物：′-AACAGCATGCAAATCGAAGAC--3′，下游引物５′--3′，引物扩增NS1基因的目的片段500bp以上引物均由宝生物工程（大连）有限公司合成。 样品利用研磨器充分研磨，利用MEM营养液进行10倍稀释，然后利用DNA和RNA提取试剂盒进行核酸抽提。 1.5 病毒核酸检测 TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）TaKaRa One Step DNA PCR Kit试剂盒进行PCR扩增，反应条件94℃ 2 min；（94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min）×35个循环，72 ℃延伸10 min，PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。 1.5.3 猪乙型脑炎病毒的扩增[3] 用Ｔｒｉｚｏｌ提取病料总ＲＮＡ，溶于无核酸酶水，用Ｑｕａｎｔ反转录酶进行反转录，体系如下：１０μｍｏｌ／ＬＰＪＥＲｄ０．５μＬ，２．５ｍｍｏｌ／ＬｅａｃｈｄＮＴＰ４μＬ，１０×ＲＴ 缓冲液２μＬ，反转录酶１μＬ，ＲＮＡ１２．５μＬ。３７℃反转录１ｈ，ｃＤＮＡ置于－３５℃备用。以ＰＪＥＦｄ和ＰＪＥＲｄ为引物，用２×ＰＣＲTaqＭｉｘ进行ＰＣＲ 反应，体系如下：２×ＰＣＲTaqＭｉｘ２５μＬ，１０μｍｏｌ／ＬＰＪＥＦｄ 和ＰＪＥＲｄ各１μＬ，ｃＤＮ