现代生化技术复习要点2015【参考】.docVIP

第一章 1.寄主的限制和修饰现象：细菌能将外来的位点上切断，从而保证其不外来噬菌体所感染，而其自身的染色体被一种特殊的酶所修饰而得保护，这种现象叫做 2.1限制性核酸内切酶Ⅱ类酶特点：识别位点严格专一，并在识别位点内将2.2Ⅱ类限制性核酸内切酶命名：属名一个字母（ 2.3限制性核酸内切酶的星号活性：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些限制性核酸内切酶的切割序列发生低特异性，这种性质称为限制性核酸内切酶的星号活性（限制性内切酶在含20℃稳定保存）2.4部分酶切： 2.5同尾酶：识别位点不同但切出的DNA片段具有相同的末端序列6同裂酶：来源不同，识别序列相同，切割位点可以相同（同序同切酶）也可以不同（同序异切酶），存在位点偏爱现象。 1甲基化酶：许多Ⅱ类限制性核酸内切酶都相应存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制性核酸内切酶识别序列中某位碱基甲基化，从而使 用途：就是在必要时可以封闭某一限制性核算内切酶的切口。 命名：在对应的限制性内切酶名字前面加 甲基化对限制性核算内切酶的影响： 3.2 T4-DNA连接酶：在实验中绝大多数情况下使用的是DNA连接酶，具有粘性末端和平末端。目前商品化的连接酶：借助’-OH和’-P之间形成的磷酸二酯键 3 S1核酸酶：来源于米曲霉菌，其特征如下： RNA，降解 2.降解发生的方式为内切和外切，产生带5’磷酸的单核苷酸或寡核苷酸 pH4.0-4.5的酸性环境，且为2+所激活 5.酶量过大时会降解双链核酸，因为双链降解活性比单链低5万倍 3.4 DNA聚合酶Ⅰ： ·5’-3’聚合酶活性——聚合作用 ’-5’外切酶活性——校对作用 ·5’-3’外切酶活性——切除修复作用（切口平移） Klenow酶：是大肠杆菌5’-3’外切酶活性，基因工程中常用该酶填平’突出的粘性末端5末端脱氢核苷酸转移酶（）：不需要模版只需要带’羟基末端引物的’末端 6碱性磷酸单酯酶：能将’端磷酸基团切除。 1载体：指运载外源DNA在体外重组成 4.2载体应具备的条件： 2.具有合适的限制性内切酶位点 3.具有合适的选择标记基因，用来筛选重组体DNA 4.能接纳尽可能大的外源4.3拷贝数：一种质粒在一个细胞中存在的数目 4多克隆位点：许多限制酶的切点 严紧型复制：除了受本身的复制机制的控制外，还受染色体的严紧控制。 ·质粒的复制是同宿主细胞的复制偶联同步的 ·在每个细胞中的质粒只有一份拷贝，或最多只有几份拷贝 松弛型复制：只受本身的遗传结构的控制，而不受染色体复制机制的约束 ·宿主细胞不合成蛋白质时，松弛型质粒仍继续进行复制，每个宿主细胞中通常具有较高的拷贝数（） ·在增殖松弛型质粒时，总是要让宿主菌经氯霉素处理抑制蛋白质的合成 不相容性：两种质粒不能共存于同一受体细胞内 1λDNA载体及类型 载体的构建：缩短长度→删除重复的酶切口→加装选择标记→构建琥珀型密码子的突变体 载体类型：插入型＆取代型 2λDNA包装和限制 ·包装蛋白在宿主细胞内合成，包装蛋白首先结合在cos区的附近，形成包装启动复合物，因此cos区对包装至关重要 ·包装时由一个蛋白因子将cos区交错切开，从而保证只有一个DNA线状分子被包装在一个噬菌体内，每个宿主细胞可包装多达100个成熟的λDNA分子 ·包装对105%，5kb，也就是说可以 ·包装好了的 7.考斯质粒及其特点 ·含有 ·由于·将这一小片段9kb），同时它仍可像λDNA一样在体外被包装成具有感染活性的噬菌体颗粒，并高效感染大肠杆菌 ·不能在体内被包装，更不能裂解细胞，其制备与质粒相同 ·进入细胞后，完全依靠质粒上的复制子进行复制 ·含有多种单一酶切位点，便于克隆 DNA片段的连接 定向克隆；外源 粘性末端：（不同粘性末端的连接） 突出末端相同（’突出）：Klenow酶补平之后连接相同（’突出）用切平，之后再用。 Klenow酶补平之后连接 平末端：属于分子内的连接，反应速度要比粘性末端的连接慢得多 方向：用Klenow补平或者用同聚结尾法都是从’-3’，切’突出用’突出用 9.提高重组率的方法： （） （）载体分子在连接前先除磷 （）用T加装人工粘性末端 10.1转化子： 10.2重组子：3转化率：产生菌落的总数定义每载体最佳转化条件下进入受体细胞的分子数 12.1转化：将质粒为载体构建的重组 12.2转染：将噬菌体（病毒） 12.3转导：以噬菌体颗粒为媒介转移 13.1抗菌性筛选法（ex环丝氨酸筛选） ·最常见的载体携带的标志是抗药性标志，如抗氨苄青霉素（）、抗四环素（）、抗卡那霉素（kanr）等 ·当培养基中含有抗生素是，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖 ·如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性