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基因1 2. 基因工程对载体的要求： （1）在宿主细胞内能独立复制。 （2）有选择性标记。 （3）有一段多克隆位点， 外源DNA插入其中不影响载体的复制。 （4）分子量小，拷贝数多。 （5）容易从宿主细胞中分离纯化。 严谨反应.指细菌生长在不良营养条件下时.由于缺乏任何一种氨基酸等因素所导致的蛋白质的合成突然下降，T.R.N.A合成突然停止等一系列反应. 报道基因：指其编码产物能够被快速的测定和判断外源基因是否已经成功导入寄主细胞并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。 无细胞翻译系统是指能把外源的信使R.N.A翻译成蛋白质的细胞提取物，如麦胚提取物系统，网织红细胞提取物系统。 辅助噬菌体：自身复制起点发生了突变，复制效率低下，但感染细菌后能表达出外壳蛋白和复制蛋白，帮助噬菌粒载体复制。 穿梭质粒载体:人工构建的，具有两种不同复制起点和选择标记，可以在两种不同寄主细胞中存活和复制的质粒载体。 科斯位点：λDNA两端各有12BP的黏性末端，黏性末端形成的双链区称为科斯位点。 套嵌引物：设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间，增加扩增引物的特异性。 反转录PCR(RFPCR)：利用反转录酶，把RNA反转录成为CDNA，再以CDNA为模板进行PCR扩增。 噬菌粒载体：是一类由丝状噬菌体DNA复制起始位点序列与质粒组成的杂合分子。 衔接物：是一段含有某种限制性内切酶识别序列的人工合成的寡聚核苷酸，通常是八聚体或十聚体。 klenow fragment:该酶实际上是大肠杆菌DNA聚合酶一的碳端的大片段，首先由klenow通过枯草杆菌蛋白酶位点特异性降解的方法从DNA聚合酶一中制备，故得此名，具有五到三的DNA聚合酶活性，三到五的核酸酶外切酶活性。 包含体：在某生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密的聚集在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种结构称为包含体。 酶联免疫吸附测定（E.L.I.S.A）的原理是:一抗与目标分子的特异性结合；二抗与一抗的特异性结合；酶连即二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质或发光，再通过比色测定有色物质的含量或光强度，从而推测目标分子含量。 步骤：1.固定样品：将待测样品加入九十六孔微量滴定班的孔中，干燥后就被固定在孔底。2.一抗结合：加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。3.二抗结合：加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉二抗只识别一抗，二抗上连着一种酶。4.显色反应：加入无色的底物，被二抗上的酶催化转变成有色物质或荧光。5.比色在特殊的分光光度仪.酶标仪.上比色，打印出结果。 局限性：准确性稍差，即主要取决于一抗的特异性。必须与其他方法一起考虑。最好用单克隆抗体。 一，反转录病毒载体的特点、构造和包装过程。 优点： （1）将DNA插入宿主基因组的随机位点上。 （2）侵染范围广、感染率高。 （3）整合的原病毒在宿主基因中比较稳定，拷贝数目较低。 （4）包装的外源DNA可达10kb。 （5）反转录病毒感染哺乳动物细胞，对宿主细胞没有毒性。 反转录病毒载体构建： （1）删除pol、env和gag基因。 （2）插入标记基因（如neor）。 （3）外源基因和启动子插入到ψ+下游。 反转录病毒载体的包装： （1）包装细胞系的构建：反转录病毒DNA转化细胞的效率很低，必须包装成病毒颗粒转染细胞。用两个缺失了ψ+的反转录病毒染色体转化细胞，以制造病毒外壳蛋白。 （2）载体RNA的包装：用载体DNA转化包装细胞系。转入的载体DNA上带有ψ+，转录成的载体RNA就会被包装细胞中原有的病毒外壳蛋白识别包装成重组病毒颗粒。 二，大肠杆菌工程菌不稳定性的表现形式及解决策略。 1，结构不稳定性：重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致,其表观生物学功能的丧失。 2，分配不稳定性 ：整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing） 。 改善基因工程菌不稳定性的策略 改进载体受体系统 1，将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中，其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 。 2，正确设置载体上的多克隆位点，禁止DNA片段插在稳定区内。 3，将受体细胞的致死性基因安装在载体上，同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的ssb基因（DNA单链结合 蛋白编码基因 ）。 施加选择压力1，根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素。 2，根据载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份 。 控制目的基因的过量表达 1，使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度。 2，使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数 。 优化基因工程菌的培养工艺 1，培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 。