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第十章 分子生物学研究方法（上） 第一节 DNA操作技术 1. 1. 多聚酶链式反应（PCR：Polymerase Chain Reaction) 2.核酸的凝胶电泳 3.其它PCR类型 Mullis的PCR构思 DNA聚合酶 dNTP 引物 引物 DNA聚合酶 特定DNA片段  DNA/RNA及蛋白质操作技术 ——DNA基本操作技术 ——RNA基本操作技术 ——蛋白质组学技术 第一节 DNA操作技术 多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction) PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种 体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA 快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝 尔化学奖。 Kary B. Mullis 模板：DNA PCR反应体系 引物：P1 P2 DNA聚合酶：Taq 原料：dNTP Taq P1 P2 Mg2+ dATP dTTP dCTP dGTP 1 Some DNA Polymerases Used in PCR Enzyme Microbial Source Thermotolerance Klenow Escherichia coli No Sequenase T bacteriophage No Taq Thermus aquaticus Yes BstE Bacillus stearothermophilus Yes Pfu Pyrococcus furiosus Yes Tth Thermus thermmophilus Yes UlTma Teratoga maritima Yes  耐热DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 100 酶 80 60 性 40 (%) 20 40 50 60 70 80 90 100 温度(℃) Saiki（1988）将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。 PCR反应循环 94℃ 变性 PCR循环  5’ 引物 3’ 3’ 5’ 变性、退火 延伸 n 扩增程序（快速） 梯度PCR仪 94℃ time 1）94℃ time 2）55℃ time 3 72 time 普通PCR仪 4）重复1-3步35次 后延伸 实时荧光定量PCR仪 2 1）影响扩增效果的PCR条件 （1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA 结合蛋白类。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 关于PCR引物设计 例题1：根据以下cDNA（互补DNA）编码区片段的两末 端已知序列，如何设计下游引物，以扩增该cDNA片段。 5′CTTCCACGACGCTATC//GAGAGATTCGCCTGCA 3′ 例题2: 如何利用网络技术和DNA分析软件设计简并引 物, 以PCR扩增某蛋白的cDNA? 演示: (1)登录NCBI等网站,收集有关cDNA序列信息; (2)利用DNA分析软件(如,DNAman等)对所收集 的cDNA序列进行比对分析,利用最保守序列设计引物。 （4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降 低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响 DNA聚合酶的活性。  （2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 引1)物设计： , （ 序列应位于高度保守区与非扩增区无同源序列。 2 15-40 bp （3）引物长度以 为,G+C宜。 40-60% （4）碱基尽可能随机分布 （5）引物内部避免形成二级结构。 （6）两引物3’间避免有互补序列。 5 （7）引物 端的碱基要求严格配对； ’端无严格 （ 8）引物中有或能加上合500bp适的酶切位点 （ ）引物扩增跨度：以 为宜，特定条件下10kb可扩增长至 的片段 3 Taq DNA （ 0）.5-2.5 U/50聚l合酶 ; 酶量过少影响反应产量。 Some DNA Polymerases Used in PCR Enzyme Microbial Source Thermotolerance Klenow Escherichia coli No Sequenase T bacteriophage No Taq Thermus aquaticus Yes BstE Bacillus stearothermophilus Yes Pfu Pyrococcus furiosus Yes Tth Thermus thermmophilus Yes UlTma Teratoga maritima Yes （5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。适宜浓度为0.