斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF146基因克隆表达.docVIP

斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF146基因的 克隆、表达与启动子活性分析 盛晔1，闵丹，2，张志芳2，朱 江1( 摘要: 【目的】研究斜纹夜蛾核型多角体病毒II ORF1的结构与功能。【方法】根据SpltMNPV II ORF1基因序列设计引物经PCR扩增克隆ORF1基因。在生物信息学分析基础上进行启动子活性分析和转录时相分析。构建ORF1片段的原核表达载体表达并纯化融合蛋白后制备多克隆抗体。【结果】核苷酸序列分析表明，读码框含 bp，编码个氨基酸的蛋白质，推定分子量为.4 kD。在病毒感染以后pET-28a-ORF13原核表达的融合蛋白经纯化后制备的多克隆抗体特异性高，效价可达13200以上。【结论】SpltMNPV II ORF1是一个早期和晚期都表达的病毒组成型结构蛋白。推测ORF146基因可能与SpltMNPV II病毒感染宿主细胞后病毒DNA复制有关。制备的多克隆抗体可用于深入研究该蛋白的生物学特性与功能。 关键词: 斜纹夜蛾； 核型多角体病毒；ORF基因；原核表达 中图分类号: Q933　　 文献标识码:A 　　 文章编号:0001（6209） 斜纹夜蛾(Spodoptera litura，Spli)又名莲纹夜蛾俗称夜盗虫[1]属鳞翅目夜蛾科一种杂食性重要农业和林业害虫危害植物共计109科389种[2,3]。由于斜纹夜蛾的食性杂、世代重叠、抗性强因此防治难度高在各种化学合成杀虫剂严重污染环境以及害虫对化学合成杀虫剂抗性日益增强的情况下生物防治愈显重要和迫切[4]。SpltMNPV）作为商品化杀虫剂已在我国一些地方推广使用，但杀虫作用的迟效性宿主域窄等缺点是发展NPV生物杀虫剂的主要障碍一些研究正试图通过分子生物学和基因工程技术来克服这主要障碍[56]。从自然界中寻找和筛选新的高毒力的病毒株系是开发NPV生物杀虫剂的另一重要途径[7]。Kamiya K等从日本全国各地野外感病幼虫收集、分离到189个SpltMNPV克隆筛选并鉴定出三种基因结构类型(A、B、C)[8]对上述三种基因结构型病毒DNA限制性核酸内切酶酶切图谱的比较研究表明[]，A型SpltMNPV与斜纹夜蛾的近缘种Spodoptera littoralis NPV (SLNPV-D)和SLNPV-B相似B型SpltMNPV与在中国、日本、菲律宾的斜纹夜蛾(S.litura)幼虫中鉴定的SpltMNPV相似[]，而C型SpltMNPV的与A型和B型的都不同进一步的生物学特性和致病性研究表明C型SpltMNPV的C3株是一种繁殖率和毒力极强的新的病毒变异株[]。李轶女GenBank登录号: NC_011616)。通过与其他几种代表性杆状病毒基因组的比较 ，发现它与具有相同宿主来源的中国株SpltMNPV G2 (SpltMNPV I)存在着非常显著的差异，却与甜菜夜蛾核型多角体病毒（SeMNPV）比较接近。是一种新的具有重要研究价值的病毒变异株，故命名为SpltMNPVⅡ[12]。质谱分析表明 ，在SpltMNPV II149个ORF中ORF146是同时存在于ODV和BV中的功能未知的基因。本研究从该病毒基因组中克隆了ORF146基因进行了序列分析时相分析和启动子活性分析并对ORF146基因进行了大肠杆菌融合表达纯化了表达产物制备了多克隆抗体为进一步研究病毒基因组的变异与生物学特性的关系、侵染机制、研究和开发新的高效生物病毒农药打下基础。 材料方法1.1.1 病毒株Spli细胞系质粒和菌株SpltMNPV的C3株SpltMNPV Ⅱ原始细胞纯化毒株由Kamiya K。斜纹夜蛾TUAT-Spli221细胞由日本名古屋大学资源昆虫研究室Michihiro Kobayashi教授提供，本实验室保存。载体质粒pMD-18T Vector 为Takaa 公司表达载体pET-28a+、受体菌E. coli TOP10和BL21(DE3)由本实验室保存。 1.2/ 方法 1.2.1多角体纯化斜纹夜蛾细胞Spli用含10%FBS的TC-100培养基27℃培养。在斜纹夜蛾幼虫5龄初期注射感染细胞纯化毒株让病毒在虫体内繁殖扩增待其发病后收集感染病虫的尸体进行研磨用蒸馏水反复清洗利用差速离心的方法纯化病毒[]。SpltMNPVⅡ基因组DNA的提取(1)取适量纯化好的病毒加入750 μ裂解液(0.1 Na2C03；0.17 mol/L NaCl；0.01 mol/L EDTA；pH 10.5) ，混匀后37℃下裂解l h(2)用0.1 HCl慢慢将溶液的pH调至8.0(3)加Sarcosyl至终浓度为0.5％Proteinase K至终浓度为0.25 mg/m混匀后37℃放置2 h后65℃放置2 h(4)用等体积的酚氯仿进行抽提(5)用2倍体积的冰无水乙醇沉淀DN