newtech--RNApulldownprotein(RNAIP方法).docVIP

lncRNA与蛋白互作技术：RNA-Protein?Pull-Down/RIP ? (2013-07-05 11:29:49) lncRNA与蛋白互作技术：RNA-Protein Pull-Down/RIP 1、Thermo fisher试剂盒 近日，赛默飞世尔科技全新推出了一款Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit，让研究人员能够以末端标记的RNA作为诱饵，轻松富集蛋白质-RNA的相互作用。与抗体捕获相比，这种方法的优势在于脱硫生物素化的目标RNA能够直接富集RBP（或复合物）。 蛋白质与RNA的相互作用是许多细胞功能的核心，如蛋白质合成、mRNA组装、病毒复制、细胞发育调控等。了解它们之间相互作用的分子机制对理解这些生物学过程非常重要。然而，之前的分析方法往往受限于使用放射性标记，或实验步骤过多，不仅耗时费力，也增加了实验结果的不稳定。 此试剂盒利用脱硫生物素末端标记的RNA和链霉亲和素磁珠标记的来高效富集RNA结合蛋白（RBP）。与抗体捕获相比，这种方法的优势在于脱硫生物素化的目标RNA能够直接富集RBP（或复合物）。此外，试剂盒还提供了经过验证的对照，适用于标记和pull-down分析，也与多个下游应用兼容，如Western blotting和质谱（MS）。 试剂盒中包含了Pierce RNA 3’-End Desthiobiotinylation Kit。它利用T4 RNA连接酶将单个脱硫生物素化的胞苷二磷酸连接到单链RNA的3’端。3’端的末端标记不干扰RNA结构，因此，比标记核苷酸的随机掺入更加理想。每个标记反应适合50 pmol RNA；不过，如有必要的话，标记反应也可扩展（从1 pmol到1 nmol）。标记反应需要20倍过量的脱硫生物素化核苷酸。对于不太复杂的RNA，孵育时间可为37°C 30分钟，若是更长或更复杂的RNA，时间也延长到4-16°C过夜。通过改变RNA与核苷酸的比例，延长孵育时间，或在标记反应中添加DMSO，可优化复杂RNA的标记效率。 RBP的富集过程经过优化，相当简单。首先将RNA与链霉亲和素磁珠结合。之后在蛋白质-RNA结合缓冲液中平衡RNA结合的磁珠，再加入蛋白裂解液。随后添加适当的缓冲液、涡旋振荡，并在磁力架上分离，洗涤磁珠。最后样品可通过非变性的生物素洗脱缓冲液或SDS上样缓冲液洗脱，用于下游分析。 此试剂盒的特点在于： 直接：直接利用末端标记的RNA捕获核糖核蛋白复合物；不需要使用抗体进行pull-down; 简单：RBP富集过程无需离心；步骤简化，在RNA标记反应后手工操作不到3小时 灵活：使用不同长度的体外转录RNA或合成RNA进行标记；可成功富集内源、过表达和体外翻译的裂解液中蛋白; 特异：磁珠背景低；未处理的RNA或突变RNA不会明显富集特定的RBP; 经济：比单独购买合成的末端标记RNA、磁珠和试剂更为经济; 完整：包含标记和富集组分及分析缓冲液；阳性对照RNA、阴性对照RNA和RBP抗体也包含在内 此试剂盒包含的试剂足够20次RNA标记反应和20次蛋白质-RNA pull-down分析使用。 2、milipore试剂盒 Magna RIP? RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit Description: Magna RIP? RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit Trade Name: Upstate (Millipore) Qty/Pk: 12 assays Product Overview: RNA-binding protein immunoprecipitation (RIP) is the RNA analog of the more well-known ChIP application (chromatin immunoprecipitation), which identifies DNA targets of DNA-binding proteins in an in-vivo cellular context. RIP can be used to identify specific RNA molecules (of many types) associated with specific nuclear or cytoplasmic binding proteins. These experiments involve immunoprecipitation of endogenously formed complexes of RNA-binding prot