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关于葡萄抗病基因的调研报告 前言 葡萄是世界栽培面积最广，经济价值最高的果树之一，但葡萄生长常遭受各种病害危害，其中葡萄霜霉病是危害葡萄最为严重的病害之一。葡萄霜霉病源于北美，18世纪末传入欧洲，后几乎遍及所有的葡萄产区，多发生于温暖潮湿的环境。葡萄霜霉病主要危害葡萄叶片，严重时也侵染果穗、新梢等幼嫩组织。葡萄染霜霉病后，染病叶片的叶背会有白色霜状霉层，有的叶背会有坏死斑。果穗受害产生脱绿的病斑，也会有白色霜状霉层，容易干枯脱落。新梢被侵染会产生凹陷的黄褐色病斑，有时也会产生白色霜状霉层（贺普超，1994；Banani et al.，2014）。 葡萄霜霉病是由真菌中的葡萄霜霉菌引起的病害，葡萄霜霉菌属于鞭毛菌亚门，卵菌纲，霜霉目，霜霉科，单轴霉属，是雌雄异株的二倍体活体营养型寄生卵菌。葡萄霜霉菌的侵染过程总是发生在潮湿的环境中，一般包括孢子囊萌发、游动孢子释放和萌发以及侵入寄主组织三个时期。其侵染循环大体又可分为有性繁殖和无性繁殖两个阶段。雄器和藏卵器通过受精作用产生融合细胞，随后二倍体卵孢子形成。卵孢子在病叶等病残组织中越冬，这是病害的初侵染源。第二年春，卵孢子在适宜的温度和湿度下产生孢子囊，孢子囊萌发后释放出游动孢子，游动孢子借风雨到达开放的气孔处，通过产生的菌丝侵入寄主组织内部，完成有性生殖的初侵染阶段。初侵染完成后，经过5-10天的潜育期，病斑气孔处伸出孢子囊梗和孢子囊，由孢子囊再产生游动孢子，进行再次侵染，既是葡萄霜霉菌通过无性繁殖完成的二次侵染阶段（孔庆山，2004；Allègre et al.，2007；Rossi et al.，2007）。葡萄霜霉菌侵染的最适温度为22~25℃，相对湿度为95%以上，其侵染程度主要随周围环境和寄主葡萄抗性不同而有所差异。 研究表明不同品种的葡萄对霜霉病的抗病性/感病性不同（Yu et al.，2012）。一般认为，圆叶葡萄对霜霉病完全免疫，美洲种葡萄对霜霉病有明显的抗性，欧亚种葡萄普遍感霜霉病。关于山葡萄对霜霉病的抗性一直存在争议。贺普超（1984）认为山葡萄易感霜霉病。宋润刚（1998）等研究发现山葡萄不抗霜霉病，但品系间感病程度差异较大。Wu等（2010）认为一些山葡萄品种属于抗霜霉病葡萄品种。Yu等（2012）通过实验发现一些山葡萄尽管发病率和病情指数都较高，但它们的菌密度值都要低于欧亚种葡萄，说明山葡萄中至少存在部分抗病性，因此被归类于较抗类别。在育种研究中，美洲种和山葡萄都是良好的抗性品种资源。 目前在生产上针对病害仍以化学防治为主，在防治葡萄霜霉病方面主要依赖于喷施波尔多液。化学杀菌剂防治病害不仅增加了生产成本，造成严重的环境污染，还可能影响葡萄的品质。此外，化学杀菌剂加速了菌株的变异，而又产生新的化学灭菌剂，使之成为一个无休止的循环。霜霉病等疾病的传播，增加了人们培育新的抗病品种的迫切需求，将抗霜霉病性状与具有优良品质的葡萄性状相结合，培育抗病品种是解决问题的更为安全、长久有效的途径。 2正文 2.1葡萄抗霜霉病研究进展 人们发现已经克隆的抗病基因产物存在一些相似的保守结构域如NB-ARC结构域、LRR结构域等，利用这些结构域设计简并引物，并从植物基因组DNA中进行扩增，扩增的产物与抗病基因有较高的同源性，这些即为抗病基因同源序列（RGA），它为筛选抗病基因或抗病相关基因提供了一种有效手段。近年来，Seehalak等（2011）在抗霜霉病的杂种葡萄NY88.0507.01和易感种黑皇后中克隆得到91个RGA序列，其中易感种黑皇后中得到42个RGA，说明RGA在抗性品种和易感品种中都可以获得。此外，Wang P等（2013）根据NBS保守结构域设计的简并引物在三种抗霜霉病葡萄（红地球、贝达和藤稔）和易感品种（无核白）的基因中扩增出10个RGA序列，与已知的R基因序列比对相似度很高，系统发生表明它们分布在两个主要NBS-LRR蛋白分支上。实时定量PCR分析出RGA1、RGA2、RGA5和RGA23在感染霜霉菌后显著表达，推测可能与葡萄抗霜霉病有关，使得克隆出抗霜霉病基因成为可能。同时RGA也可作为分子标记，构建遗传图谱。Di Gaspero和Cipriani（2003）将葡萄的两个RGA家族转化为与抗病性相关的STS标记，为进一步筛选抗霜霉病基因提供了条件。Tantasawat PA等（2012）把13个RGA-SSCP（抗性基因类似物单链构象多态性）标记与71种抗霜霉病的葡萄性状进行分析实验，这71种葡萄是抗病品种和易感品种7个杂交组合所得到的子代。用简单的线性回归分析RGA-SSCP标记，结果发现有1个RGA-SSCP标记与抗霜霉病有关。研究还发现RGA-SSCP标记在葡萄早期就能有效的检测出对霜霉病的抗性。 许多如抗霜霉病这样的