第二代测序的法医学运用.docVIP

第二代测序技术及其法医学运用 基因组DNA碱基序列差异是不同个体间最本质的遗传差异，对碱基序列的测定，人们一直在努力探索。到目前为止测序技术经历了三代发展。第一代测序技术以Sanger双脱氧核苷酸链终止法和Maxim降解法为代表，但由于Sanger双脱氧核苷酸链终止法比Maxim化学降解法需要更少的有毒化学药品，放射性同位素标记[]，因此它成为了DNA测序常用的技术，而且其测序准确性高，被认为是确定基因序列的金标准。第一代测序技术，因其操作简单，读长长，而被广泛运用。但第一代测序无法实现一次大样本测序，而且耗时长，成本高。以高通量、低成本为主要特点的第二代测序技术应运而生。二代测序技术(又称下一代测序技术，next generation sequencing ,NGS)主要包括Roche公司的454测序技术、Illumine公司的Solexa测序技术和ABI公司的SOLID测序技术。二代测序技术比起一代测序技术在测序通量、成本、时间等方面都有突破。二代测序技术最主要的特点就是通量高，一次能对多个样本同时测序，但是二代测序技术因其高通量的同时会带来相对短的读长，这是二代测序技术发展面临的主要问题。第三代测序技术（又称为 next-next-generation sequencing）是以单分子测序为主要特征，而不经过前期文库的构建、PCR扩增目的基因片段，使测序更为精确。目前对DNA单分子直接测序的第三代测序技术还在研究。第二代测序技术操作简单、通量高、成本低，仍是目前应用较为广泛的技术。本文就二代测序技术及其法医学运用做简要介绍。 第二代测序技术 Roche公司的454测序技术，利用焦磷酸测序的原理，通过DNA延伸时产生的焦磷酸盐来确定碱基顺序。即如果加入的未标记的dNTP与模板链互补，在DNA聚合酶的作用下产生等摩尔的焦磷酸盐（ppi），焦磷酸盐在硫酸化酶、荧光素酶的作用下转变成荧光，根据加入的dNTP的类型和荧光信号的强度，可以确定模板DNA核苷酸的序列。454测序技术优势在其读长相对于其他二代测序较长，可达400bp以上。 Illumina公司的Solexa测序技术采用边合成边测序的技术，将不同荧光标记的带有可逆终止物的4种dNTP投入反应体系中，如果荧光标记的dNTP在聚合酶的作用下结合到引物末端，就会释放出焦磷酸盐，在一系列酶的反应下会产生荧光。而且其3端可逆的终止物就会阻止下一个核苷酸的结合，这样就保证了一次只结合一个dNTP,当检测器读取到产生的荧光后，3端的终止物就化学性的移开，随后加入第二个核苷酸。Solexa测序技术与454测序技术都是基于聚合酶合成测序的原理，不同的是454测序技术加入的核苷酸是未带有荧光标记的，而且一次加入一个核苷酸，如果加入的dNTP与模板链互补，产生ppi经过一系列反应产生荧光，如果不结合就不产生荧光，检测仪就没有信号。Solexa测序技术是在一个体系中一次加入4种不同荧光标记的dNTP，通过3端可逆终止子来控制反应一次只加入一个dNTP。Solexa测序技术的优势在于高通量。 ABI公司的Solid测序技术是通过连接酶进行的连接测序，而不是通过DNA聚合酶进行的合成测序。Solid测序技术采用“双碱基编码原理”，用带有4种不同荧光标记的8碱基单链荧光探针混合物与引物进行连接，其中探针3’端1-5位为随机碱基，可为“A、T、C、G”中任一种碱基，1、2位的碱基决定着探针颜色的类型，1、2位碱基共用16种组合，对应4种颜色，因此每种颜色对应4种碱基对。而6-8位为特殊碱基，能与任何碱基配对。单向Solid测序反应包括5轮测序反应，每轮有多次连接反应，每轮测序反应的第一次连接由连接引物介导，当引物连接一种8碱基荧光探针，Solid测序仪记录探针第1、2位代表的颜色信息，随后连接的8聚物在第5、6位碱基处裂开，暴露出探针第5位碱基的5’磷酸，为下一次连接反应做准备。第一轮第一次测序反应使合成链多5个碱基，得到模板序列1、2位碱基对应的颜色，由此，第二次反应得到模板序列第6、7位碱基颜色，依此类推。5轮测序反应的连接引物长度相同，但在引物区域的位置相差1个碱基，这种设计使每轮连接反应的起始碱基不一样，从而能检测出上一轮测序反应未检测的碱基。第一轮连接反应的引物为n，得到的是第1、2，第6、7位等碱基的颜色信息，第二轮引物为n-1，得到第0、1，第5、6位等碱基颜色信息。第三轮引物为n-2，得到第4、5，第9、10等碱基颜色信息。第四轮引物为n-3，得到第3、4位等碱基颜色信息，第五轮引物为n-4得到第2、3位等碱基信息。这样五轮反应后，按照第0、1位，第1、2位……的顺序把对应模板序列的颜色信息连接起来，就得到由0、1、2、3......组成的Sol