Genediagnosis概要.ppt

基因诊断 Gene diagnosis 基因诊断 1、定义：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达是否正常，从而对疾病作出诊断。 4、特点： 1）针对性强 2）高度特异性 （杂交技术、探针） 3）灵敏度、精确性高 4）早期快速诊断 5）适用性强、诊断范围广 （内、外源基因或非活化基因） 5、临床意义及优缺点 1)临床意义： 疾病分型 优生优育 组织配型 鉴别病原体的基因型、明确病原 2）缺点： 一、分子杂交 依据DNA双链碱基互补、变性、复性的原理，检测样品中是否存在与其互补的同源核酸序列。 （一）探针（probe） 1、定义：一段与被检测的核苷酸序列互补的带标记的核苷酸片段。 （二）种类 1、基因组DNA探针 基因组文库中，选取外显子序列，避免高度重复序列。 2、cDNA探针 理想 3、寡核苷酸探针 人工合成的探针，适合点突变分析，反应需时短。 20-50bp； G-C对40-60%； 探针内部无互补序列； 4bp，同一碱基4个连续出现； 避免与非靶序列同源（〈70%或连续8个碱基相同）。 4、RNA探针 较少应用，易降解，不易操作，多由cDNA经体外转录得到 特点： 1）RNA/RNA、RNA/DNA稳定性 DNA/DNA，特异性高 2）无互补链，杂交效率高 3）无高度重复序列，非特异性杂交少 4）杂交后RNA可去除,降低本底。 （三）标记物 1、高度灵敏性 2、不影响碱基配对的特异性 3、不影响探针的主要理化性质、杂交稳定性和特异性，Tm无较大改变 4、酶标时，不影响Km、酶活性 5、特异性高、假阳性率低 6、化学稳定性高、保存时间长、操作简便、无污染、无害、价格低廉。 1、放射性核素 优点：灵敏性（10-14~10-18g)、特异性高。 缺点：放射性污染； 射线损伤探针分子； 半衰期短，随用随标，标记后立即使用； 稳定性差； 反应需要时间长。 常用放射性核素 （1）32p ATP a、g位标记 （2）35S （3）3H （4）125I 2、非放射性标记 特点：灵敏度低；稳定、安全、经济、实验周期短。 （1）生物素（biotin） 水溶性维生素，与尿嘧啶环C5相连 （2）地高辛（Digoxigenin，Dig）－免疫酶学检测 类固醇类半抗原，与尿嘧啶环C5相连， Dig-UTP、 Dig-dUTP 、Dig-ddUTP （3）荧光素；FITC 被UV激发出荧光观察，主要适用于原位杂交 （4） Amersham 公司ECL（增强化学发光自显影，enhanced chemiluminescence） Progema公司LightsmithTMII Luminescence Engineering System （5）光密度、电子密度标记物 　金 、银 （四）标记方法 1、体内标记法（in vivo） 2、体外标记法（in vitro） 酶促标记法 化学标记法 杂交方法 固相杂交 相关技术：印迹技术(blotting) （一）核酸分子杂交（hybridization ） Southern blot:将电泳分离的DNA片段转移到固相支持物上 Northern blotting: 将电泳分离的RNA片 段转移到固相支持物上 斑点或狭缝杂交法(dot blotting) 原位杂交(tissue in situ hybridization) 等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法(allele specific oligonucleotide,ASO) DNA芯片技术(DNA chip, DNA array, DNA microarroy) 菌落杂交法 夹心杂交法 杂交信号的检测 一、放射自显影： 二、非放射性探针的检测 1、偶联反应 ：免疫反应与显色体系 2、显色反应： 　　　　 酶促显色法 碱性磷酸酶 （AP）BCIP/NBT 辣根过氧化物酶（