HCV病毒分子分型方法_海口丙肝医院概要.ppt

HCV分子分型方法 海南中医药研究所附属琼岛医院肝病中心 丙肝病毒HCV 1975年, 英国Lancet杂志首次使用非甲非乙型肝炎这个名词 1989 年, HCV cDNA 克隆成功, 并正式命名HCV 1991年国际病毒命名委员会( ICTV ) 将HCV 归为病毒科丙型肝炎病毒属 HCV全球分布情况 HCV基因 其基因组为单股正链RNA, 易变异。 全长9. 6 kb 341 b的5‘非编码区( 5’NTR, NCR, UTR ) 27b的3’非编码区( 3‘NRT )。 在病毒复制中, 氨基酸有三个蛋白( C、E1、E2 /NS1) 羧基端有4个蛋白( NS2、NS3、NS4、NS5) HCV 基因分型分类系统 不同的研究者建立并使用各自的HCV 分类系统 主要的命名系统有: Chan系统、Simmonds 系统、Okamoto 分类系统、Kanazawa命名系统 第二届HCV 与相关病毒国际讨论会议上, 制定了统一的命名系统--Simmonds系统, 目前认为主要有6种HCV基因型及不同亚型, 以阿拉伯数字表示HCV 基因型, 以小写的英文字母表示基因的亚型(如1 a、2 b、3 c等)。 HCV 基因型分布 北美: 1, 3, 2 南美: 1, 2, 3 欧洲: 1, 3, 2 非洲: 2, 1, 3, 4, 5, 6 亚洲: 2, 1, 3, 4, 6 中东: 4 中国：1b，2，6 HCV 基因分型区域的选择 最准确的方法就是对基因组的某个区进行PCR 扩增、测序及进化树分析, 选择的区有NS5、Core、E1和5‘UTR 通常建立在5’ UTR, 因为该区是HCV RNA 诊断实验的常用区域 基因分型的分子学方法 （1）测序法：测全长或片段 金标准 费时费力 不适于临床 （2）基因型特异性引物PCR法 Okamoto等首先采用 分型的效果仍比较差 需使用7对引物 Okamoto H et al. J Gen Virol. (1992) Typing hepatitis C virus by polymerase chain reaction with type-specific primers: application to clinical surveys and tracing infectious sources. ( 3)型特异性探针杂交( LIPA ) 将生物素或荧光素标记型特异性探针固化相化在膜或芯片 与RT- PCR扩增的病毒产物进行杂交 是建立在5’非编码区基础上 有5% ~ 10%的1 a、1 b 型不能鉴别, 也不能区别2 a 和2 c 型。 Stuyver L，Wyseau A，Maertens G，et al. Second generadon line probe assay for hepatim C virus genotyping [J]jourhal of Clinical Microbiology，1996；34：2259． HCV genotypes in Northern Italy: a survey of 1368 histologically proven chronic hepatitis C patients ( 4)限制性片段长度多态性分析( RFLP)法: 用能识别特定酶切位点的限制性内切酶将PCR 扩增的片段切割成不同长度的片段 该方法常用的酶为HaeIII、RsaI 、Mva I 、Hinf I、Scrf I 该方法检测基因型的精确度为97％ 不能区分所有的HCV基因亚型 也不能识别在泰国和越南发现的变异基因型， Davidson F, Simmonds P, Ferguson JC, et al. Survey of major genotypes and subtypes of hepatitis C virus using RFLP of sequences amplified from the 5′non-coding region. J Gen Virol, 1995, 76:1197-1204. ( 5)遗传发育关系进化树 对一定区域的样本测序结束后可将序列互相比较 分析样本间序列的进化距离, 画出该区域内HCV 流行的关系进化树, 观察HCV 在区域内的分子流行情况及特点 （6）特异引物错配延伸法(PSMEA)： 利用taq酶在引物3‘末端发生错配时无法继续延伸 借助荧光测量仪检出错配峰出现的频率达到分型目的 该方法成为检测混合HCV基因型感染的方法．比直接测序灵敏度高20倍 Antonishyn NA, Ast VM, McDonald RR. et al.Rap id genotyping of hepatitis