MGMT-甲基化试剂盒研发概要.pptVIP

3 3 人类MGMT基因（启动子）甲基化检测(MSP法)试剂盒研发项目分享 主讲人：刘骏珲 技术支持：刘旭宏 抑癌基因 它可以通过多种信号传导途径以及蛋白-蛋白之间的相互影响起作用，影响细胞生长、分化、转移、粘连、增殖及细胞周期，促进凋亡，抑制肿瘤细胞的转移和侵袭。 MGMT基因启动子 1.与癌症相关 脑胶质癌 肠癌 口腔癌 肠癌 MGMT基因启动子发生甲基化 研发思路 MGMT甲基化检测试剂盒研发 引物的筛选 引物性能的评估 引物优化比例的确定 初步检测体系的建立 多因素优化设计 DNA质控体系建立，甲基化标准品合成 基因残留质控 转化成功质控 98%转化参考品构建 筛选合格样本 甲基化浓度梯度参考品 甲基化水平的检出 检测流程的建立 分析性能评估 检测体系建立 HANDS系统的引入 检测位点确定 通过文献调研确定MGMT基因启动子区域 甲基化CpG岛预测并与文献比较 ACGAACGTCGAAACGCAAAACGTTCTAAAAACGCG 共7个潜在CpG位点 MGMT甲基化标准品构建 1.确定目标序列，设计引物 2.重叠延伸PCR制备DNA 3.菌液培养 4.浓度标定 5.测序验证 DNA重亚硫酸盐转化体系确定 供应商选择 1.天根DNA重亚硫酸盐转化试剂盒(DP215) 2.EpiMark重亚硫酸盐转化试剂盒 3.EZ DNA Methylation?-GOLD Kit 转化程序选择 1. 98°C for 10 minutes 2. 53°C for 30 minutes 3. 53°C for 6 minutes OR 4. 37°C for 30 minutes 5. 4°C storage（3-4步 8循环） qPCR体系建立 三大体系 G体系 针对人类基因组DNA设计 P（非甲基化）体系 根据转化后序列（非CpG位点设计探针） L（甲基化）体系 覆盖CpG位点（全甲基化）的长探针 引物探针设计 HANDS系统引入 1.减少引物二聚体 2.增加结合效率 3.增加酶切活性 4.保护碱基 HANDS系统 5 3 5 3 针对基因组DNA转化模板引物的筛选实验 实验结果表明：F1R2 检测Ct值靠前，扩增效率较高，因此拟采用这对引物作为检测引物 F1R2 F1R1;F1R3;F2R2;F2R3;F3R2;F3R3;F4R2 淬灭探针 甲基化长探针 BHQ FAM BHQ 针对基因组DNA转化模板探针以及引物HAND的筛选实验 实验结果表明：AT-F1R2+POBE2检测Ct值靠前，扩增效率较高，因此拟采用这对引物作为检测引物 F1R2+PROBE1 AT-F1 AT-R2+PROBE1 F1R2+POBE2 AT-F1 AT-R2+POBE2 反应体系优化 1.体系中Buffer，Mg2+,引物浓度等优化。 2.添加剂优化：蔗糖，NH4+, BSA 针对基因组DNA转化模板检测体系添加剂体系筛选 实验结果表明：在反应体系中不添加任何添加剂对检测的效果较好; F1R2+PROBE2 F1R2+PROBE2+20um蔗糖 F1R2+PROBE2+4.6mM NH4+ 1R2+PROBE2+K+; F1R2+PROBE2+0.1%BSA 分析性能评估 1.特异性考察 2.梯度标准品验证 3.反应体系稳定性 4.灵敏度考察 针对实验室保存正常人类基因组DNA转化模板检测应用甲基化检测探针检测其特异性 结果表明，目前合成的甲基化检测谈针对甲基化样品的探针对于临床正常非甲基化样品不能检出，特异性强，而采用非甲基化探针可以检测信号。 应用甲基化检测探针检测其MGMT基因甲基化梯度参考品 实验结果表明：目前体系针对不同