培训课件_分子生物学复习.ppt

2. 注意事项： 1）DNase I 消化后，需要充分除去反应中的蛋白质。 2） DNase I 的用量是关键，其 终浓度为0.1~1.0 ug /ml。 3）核蛋白提取物最好进行部分纯化。 4）确保只有一条链的5’ 或3’ 端被标记 。 5）进行化学测序可直接读出被结合的精确序列。 甲基化干扰足迹法 甲基化干扰法原理与DNase Ⅰ足纹法正好相反，即DNA先用甲基化试剂进行随机修饰，然后用DNA结合蛋白与此DNA进行结合反应，由于被修饰的DNA结合位点，不能与DNA结合蛋白结合，这样就可以分离并回收结合和未结合蛋白的DNA，并用特殊方法将DNA从被修饰的碱基处进行切割，而结合蛋白的DNA由于未被修饰而不能被切割，但结合位点外的被修饰区域仍有切割，这样结果与DNase Ⅰ足纹法相同，在结合位点形成一个空白区。 染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay，CHIP） 是一种在体内研究DNA-蛋白质相互作用的理想方法，相对于传统的其它研究蛋白与DNA相互作用的方法（比如EMSA， electrophoretic mobility shift assay），ChIP技术能更加真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。 主要步骤： 第一步，在甲醛固定后分离和破碎染色质； 第二步，使用感兴趣的蛋白的抗体完成特定染色质片段的免疫沉淀； 第三步，分析免疫沉淀片段以确定出靶标DNA是否与感兴趣的蛋白结合。 甲醛交联 超声波切割 免疫沉淀 抗DNA结合蛋白的抗体 解除交联 抽提基因组DNA 定量PCR检测 1、引物长度 一般为15-30个核苷酸，一般为20～27mer。 在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。 2、 （G＋C）含量 GC含量一般40-60%，一般 50%。 引物Tm值一般要求：55℃-65℃。 对于低于20个碱基的引物，Tm=4(G+C)+2(A+T) 对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数 Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15 GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性； GC含量太高也易于引发非特异扩增。 3、 碱基的随机分布 A 、T、 C、 G 4 种碱基随机分布 同一碱基连续出现不应超过4个 4、引物自身不应存在互补序列 引物自身形成发夹结构，会因空间位阻而影响其与模板结合。 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ATACAGT— — —GTAT T A G C A T A T G T A 5、两引物之间也不应互补 尤应避免3′端的互补，以防止引物二聚体的形成。 引物之间不能有连续4个碱基的互补。  3′ 5′— — — ATCGA TAGCT — — —5′ 3′ 6、引物3′端 引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰。 3′ 5′ ATCGA —— T～～～ 5′ 3′ 7、引物5’端 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列和保护碱基。 5’端的修改某个碱基，引入该位点的点突变。 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。 ～～～～ 3′ 5′ 6～8mer 4mer 30mer 3’ 5’ 3’ 5’ 限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记 8、引物的保守性与特异性 保守性：通用引物——检测同一类病原微生物尽可能多的型别 特异性：避免非特异性扩增 引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测，与非特异性扩增基因同源性应小于70％。 9、上游引物与模板一致，下游引物与模板互补 5′ATCGAT — — — CGTAA 3′ 上游引物： 5′ATCGAT — — —3′ 20mer 下游引物： 5′TTACG — — —3′ 20mer 1、引物长度 一般为15-30个核苷酸，一般为20～27mer。 在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。 2、 （G＋C）含量 GC含量一般40-60%，一般 50%。 引物Tm值一般要求：55℃-65℃。 对于低于20个碱基的引物，Tm=4(G+C)+2