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产β—甘露聚糖酶菌株育种及培养基优化 　　摘要：利用实验室筛选保藏最高酶活为10.7 U/mL的白腐真菌作为出发菌株，进行紫外诱变育种及培养基优化，以期提高菌株产β-甘露聚糖酶能力。结果表明，紫外诱变条件为孢子悬液浓度106～107个/mL，诱变时间10 min，此条件下的孢子致死率达78%，获得了13株正向突变株，经6代遗传稳定性试验证明UV-2突变株酶活最高，遗传稳定性最强，比出发菌株酶活提高了2.075倍。通过单因素试验确定了该突变株的最佳碳源、氮源分别为魔芋粉和硝酸铵，对酶活影响较大的无机盐为磷酸二氢钾。通过正交试验，确定了最佳产酶培养基为魔芋粉4.0 g/L、NH4NO3 5.0 g/L、KH2PO4 5.0 g/L、NaCl 1.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L，在此条件下测得甘露聚糖酶最大酶活为46.17 U/mL，比优化前提高了40.3%。 　　关键词：β-甘露聚糖酶；白腐真菌；诱变；正交试验；培养基优化 　　中图分类号：Q933；Q93-335 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）16-3820-04 　　在世界能源日益短缺的形势下，植物纤维作为可再生有机资源越来越受到重视，其主要成分为纤维素、木质素和半纤维素。半纤维素约占植物干重的35%，含量是仅次于纤维素的杂聚物生物资源，其中最具代表性的两种半纤维素是木聚糖和甘露聚糖[1]。β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）可降解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的β-1，4-D-吡喃甘露糖主链[2]。微生物来源的β-甘露聚糖酶具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点[3]，近年来随着人们对自然界中半纤维素资源的开发和对甘露低聚糖保健价值的发现，微生物甘露聚糖酶再次成为研究热点[4-6]。不同来源的β-甘露聚糖酶对不同底物的作用程度及其水解产物是不相同的[7-9]。甘露聚糖酶具有广泛的工业应用价值，可用于饲料、食品、轻工和石油行业等[4，6-9]。 　　试验利用江苏省生物质转化与过程集成工程实验室保藏的白腐真菌，采用紫外诱变的方法使出发菌株酶活提高，并采用正交试验进行培养基的优化以进一步提高酶活，以期为甘露聚糖酶的进一步研究打下基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　菌种：白腐真菌，由江苏省生物质转化与过程集成工程实验室筛选保藏。 　　仪器：LDZX型自动立式电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；BCM-1000超净工作台（上海和呈仪器制造有限公司）；QYC-211恒温摇床（上海福玛实验设备有限公司）；721型分光光度计（上海棱光技术有限公司）。 　　1.2 培养基及配制方法 　　1）固体斜面培养基：PDA培养基。 　　2）筛选培养基：魔芋粉5.0 g，NaCl 2.0 g，琼脂20.0 g，加去离子水至1 000 mL，pH 6.0[10]。 　　3）发酵产酶液体培养基：魔芋粉5.0 g，蛋白胨5.0 g，KH2PO4 1.0 g，NaCl 1.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，加去离子水至1 000 mL，pH 6.0。 　　1.3 试验方法 　　1.3.1 培养条件 种子培养基和产酶培养基均在250 mL三角瓶中装液100 mL，摇瓶中加入10颗玻璃珠。摇瓶培养条件均为26 ℃、150 r/min。种子培养时间为24 h，接种量为10%。 　　1.3.2 β-甘露聚糖酶酶活测定方法 　　1）甘露糖标准曲线的绘制。取0.01 mol甘露糖，用0.05 mol/L的醋酸钠缓冲液（pH 4.5）溶解定容至100 mL，制成浓度为100 μmol/mL的甘露糖储备液。分别移取100 μmol/mL的甘露糖储备液至100 mL容量瓶中，用去离子水配制成浓度分别为1、2、3、4、5、6 μmol/mL的甘露糖溶液。分别在不同试管中各移取1.00 mL上述6种不同浓度的甘露糖溶液及1.00 mL缓冲溶液，再分别添加DNS 2.00 mL，沸水浴5 min，取出冷却至室温，加去离子水10.00 mL，在540 nm处测定吸光度[11，12]。 　　2）粗酶液的制备。取发酵液8 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液。 　　3）甘露聚糖酶活力的测定。将魔芋粉溶于pH 6的磷酸钠缓冲液中配制20 g/L的溶液作为底物，在0.9 mL底物中加入0.1 mL适当稀释的粗酶液，于50 ℃水浴反应10 min[2]，加入DNS试剂2.0 mL，沸水浴5 min显色，立即以流动水冷却至室温，加去离子水定容至10.00 mL，以空白液调零，在540 nm处测定吸光度。每分钟产生1 μmol还原糖所需酶量定义为1个酶活力单位（U）[11，12]。计算公式如下