1-細胞色素C的制备和含量测定.docVIP

细胞色素C的制备和含量测定 摘要：本实验以新鲜动物心脏为原材料，进行了细胞色素C的制备和含量测定。细胞色素C易溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可用酸性水溶液提取，利用还原型细胞色素C水溶液在波长520nm有最大吸收值的特征，用分光光度法测定其质量浓度并计算出粗制品的总量。 关键词：细胞色素C；制备；含量；测定 引言： 细胞色素C包括多种能够传递电子的含铁蛋白质总称。广泛存在于各种动植物组织和微生物中。它是呼吸链中极重要的电子传递体，细胞色素C（cytochrome c，CytC）只是细胞色素的一种。它在呼吸链上位于细胞色素还原酶和细胞色素氧化酶之间。线粒体中的细胞色素绝大部分与内膜紧密结合，仅有细胞色素C结合轻松，较易被分离纯化。细胞色素C为含铁卟啉的结合蛋白质，每个细胞色素C分子含有一个血红素和一条多肽链。分子质量约为13000，蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成，其中赖氨酸含量较高，等电点10.2-10.8，含铁量0.37-0.43%。它易溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可用酸性水溶液提取。本实验以新鲜动物心脏为材料提取制备和纯化细胞色素C，得到其粗品溶液，其中是细胞色素C氧化型和还原型混合物，加入少量联二亚硫酸钠，使混合物中的氧化型转变为还原型，利用还原型细胞色素C水溶液在波长520nm有最大吸收值的特征，用分光光度法测定其质量浓度（mg/ml），并计算出粗制品的总量（mg）。为了解制备蛋白质样品的一般原理和步骤提供实验依据和技术支持。 1 材料 1.1 材料 新鲜（冷冻）动物心脏样品。 1.2 试剂 （1）25%(NH4)2SO4，12%BaCl2，联二亚硫酸钠。 （2）人 沸石：白色颗粒，不溶于水，溶于酸。选用40-60目。20% 三氯乙酸（TCA）、1 mol/L H2SO4（55.5ml/L）、0.2% NaCl、1mol/L NH4OH（67.6ml/L）溶液、细胞色素C标准液（1 mg/ml）。 1.3 仪器 绞肉机、电磁搅拌器、离心机、纱布、pH试纸、层析柱（1×10cm）、分光光度计、透析袋等 2 实验方法 2.1 材料处理 新鲜或冷冻动物心脏，除尽脂肪、血管和韧带，洗尽积血，切成小快，放入绞肉机中绞碎（两遍）。 2.2 细胞色素C粗品制备 2.2.1 称取心肌碎肉200克，加自来水300毫升酸化水（水预先用6~8毫升，1mol/L的硫酸酸化）。用电磁搅拌器搅拌提取，再用1mol/L的硫酸调PH=4.0（需要不断调整），搅拌提取1.5小时。用1mol/L的氨水调PH=6.0，停止搅拌。四层纱布挤压过滤，收集滤液。 2.2.2 用1mol/L的氨水调滤液PH=7.2-7.5，利用等电点沉淀杂蛋白，静置20~30分钟，使沉淀沉下。虹吸上部清夜，过滤除杂质，下部浑浊液离心（3000rpm,15min）。合并得到的红色清液，测量体积。 2.2.3 吸附： 每人称取人造沸石4g，加水搅拌，除去12s内不下沉的细颗粒。向柱内加去离子水至1/2体积，然后边搅拌边连续、均匀地将预处理好的人造沸石水溶液装填入柱，避免柱内出现气泡。装柱完毕，打开柱下端夹子，使柱内沸石面上剩下一薄层水。 将中和好的澄清滤液小心加到沸石上面，勿冲动沸石，使之流入柱内进行吸附，控制流出液的速度不超过5ml/min。随着细胞色素C被吸附，人造沸石由白色变为红色，流出液应为淡黄色或微红色。 2.2.4 洗脱 吸附完毕，可在柱内洗涤：依次用30ml自来水、去离子水、0.2%氯化钠溶液、去离子水洗柱。然后用25%硫酸铵溶液洗脱（流速小于2ml/min），收集红色洗脱液（洗脱液一旦变白，立即停止收集），测量体积（控制在10ml左右）。洗脱完毕，人造沸石回收，可再生使用。 2.2.5 盐析 为了进一步提纯细胞色素C，向洗脱液中缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌，使硫酸铵溶液浓度为45%（约相当于67%的饱和度，即100ml洗脱液加17g硫酸铵），放置过夜，杂蛋白沉淀析出，过滤，收集红色透亮的细胞色素C滤液，测量体积。 2.2.6 TCA 沉淀 按8%体积滴加20%TCA，边加边搅拌。此时细胞色素带正电荷，与其结合生成可逆沉淀析出，立即离心（3000rpm，15min）,收集沉淀（若上清液仍为红色，倒出后再补加5%体积的TCA，再次离心，收集沉淀）。沉淀用少量去离子水溶解（体积不超过10mL）。 2.2.7 透析 溶解液装入透析袋对自来水（30min）、去离子水（10~20min）透析（用磁力搅拌器搅拌），用BaCl2 检测袋周围水的（用试管收集流下来的透析液约1ml，滴加1-2滴BaCl2试剂至试管中。摇匀若无白色沉淀，表示透析完全）。过滤除去不溶物质，得到细胞色素C的粗品液，量体积，测定其含量。 2.3 细胞色素C粗品液质量浓