組織切片製作過程概要如下步驟.docVIP

南台科技大學 生物科技系 學生專題 石蠟切片Paraffin Section 研究生:495H0069詹琬汝 指導教授:陳勝咸 中華民國九十九年五月 第一章緒論 1-1、研究動機 石蠟切片技術雖然是個老技術，但也是最基本的方法，它可與其他新的技術方法相結合，使傳統的老技術擴大了應用範圍，也開闢需多新的領域，增加許多新研究、觀察內容。隨著新儀器及新研究技術不斷的問世，使細胞組織的觀察研究從簡單的型態架構深入到各種成分的定性觀察，又從定性轉向定量計測，使細胞組織的型態、功能及代謝三結合，而達到定性可靠、定位準確及定量可測。 石蠟切片與染色的觀察算是種形態學，但對於學術研究上也是不可缺的一環。製作過程繁多，常需要數日才能完成，但組織切片可以長期保存，也可提供教學研究或是病理診斷及複察，並可利用蠟塊作其他項目的回顧性研究。 1-2、研究目的 主要利用石蠟對組織進行包埋、切片的方式，得到想要的樣品組織。進一步針對大白鼠的Brain、kidney、liver進行HE stain 觀察。 下列是細胞的基本構造，也是組織切片主要觀察項目： 1.細胞膜(cell membrane)：是由磷脂質與蛋白質組成，為隔開細胞內外的一層薄膜，具有選擇性的能力可控制物質進出細胞內外。 2.細胞質(cytoplasm)：細胞膜以內、細胞核以外的半透明液體統稱細胞質，其半流體物質稱基質(matrix)，內含細胞呼吸所需的酵素。有許多的胞器，大多細胞的代謝活動都在細胞質進行。 3.細胞核(nucleus)：位於細胞中央，由核膜(nuclear membrane)、核液(karyoplasm)、染色體(chromosome)、核仁(nucleolus)所組成圓形的形狀。具有控制生長和代謝作用，核膜上具有可讓核內物質進出的孔道。 第二章研究方法與材料 2-1、材料： 1.SD大白鼠 8-10週 2. 剃毛器 3.麻醉劑 (Urethane) 4.食鹽水(Saline) 5.肝素(Heparin) 6. 鑷子 7.止血鉗 8.大剪刀 9.小剪刀 10.鉗子 11.載玻片 12.蓋玻片 13.97％酒精 14.烘箱 15.溫度計 16.冰桶 17. 石蠟 18.染劑： (1)二甲苯（Xylene） 　　(2)酒精酸（Acid Ethanol） 　　(3)蘇木紫染劑（Hematoxylin） 　　(4)伊紅染劑（Eosin） 　　(5)封片膠（Permount） 19.儀器： 包埋機 水浴槽 石臘旋轉式切片機 光學顯微鏡 2-2、研究方法： ＜一＞、取樣品組織--動物灌流法(Introcardiac Parfusion of Animal): 1.使用Urethane（麻醉劑），劑量為500mg/kg，注射大鼠的腹腔。 2.將打麻醉後的大鼠使用鐵架架置洗手台上，等待大鼠麻醉這段時間可以準備待會所要使用的器具。 3.先用小剪刀以橫向方向剪開腹腔表皮，再用大剪刀以直向方向剪開肌肉,往上剪至頸部下方（PS：此步驟要注意別剪到胸腔中央的動脈。） 4.馬上用2支止血鉗固定2邊肋骨，開腔露出心臟,由左心室注入約300cc 0.9% Nacl後,剪破右心房上的心竇進行放血。 （PS：此步驟速度要快否則器官上會留有血色。判斷放血方法：1、心竇流出的血色變淡。2、當肝臟顏色退色成心臟一樣。） 5.用小剪刀和鑷子小心的將心臟.肺臟、肝臟、脾臟、腎臟一一取下。 6.取腦的部份：用小剪刀以T字型將頭皮剪開，左手固定頭部右手拿鉗子，沿著大腦兩邊剪碎頭骨再用勺子扳開頭骨，先切斷腦部周圍的膜和骨隨，再小心挖取腦部。 7.取樣完畢後，浸泡在10％Formaldehyde（福馬林）放置-4℃冰箱裡,等待接下來的樣品處理。 ＜二＞、組織切片製備—封埋 1.將樣品組織切成長方形或梯形以不超過石蠟框底模大小為基準，把樣品組織放入塑膠製的包埋夾內，放置固定液（10％Formalin solution＋4%甲醛）中約４～５小時，使組織的蛋白質凝固保持原始狀態。 2.固定完成後，開始進行脫水步驟，從１５％、４０％，一直到１００％的絕對酒精，濃度從低到高可把組織內部水份帶出，才能進行浸潤步驟。 Acetone濃度（％） 浸泡時間（hr） ７０ １ ８０ １ ９０ １ ９５ １ １００ １ 3.浸潤前用Xylene（二甲苯）將殘留在組織內的酒精洗乾淨。 4.處理過後的組織連同包埋夾放入石臘溶融器的軟石蠟區中，在此區潤浸約３０～６０分鐘。 5.將包埋夾移至石臘溶融器的熱金屬板上打開，並選取適當的金屬製底模，注入少許以溶化的石臘，以鑷子夾取組織埋入，並把包埋夾底部壓蓋在組織的上方，再注入硬石臘至滿