FISH在實体瘤中的应用.docVIP

FISH技术在实体肿瘤基因检测中的应用　 更新时间：2008-11-08 10:15:01 作者： 中山大学中山医学院病理学教研室 附属第一医院病理科 李智 　 概 述 荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH）是在原有的放射性原位杂交技术基础上发展起来分子细胞遗传学技术 应用于基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学研究等 其基本原理是通过标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，获得细胞内多条染色体(或染色体片段)或多种基因状态的信息 用已知的荧光素标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位 采用生物素标记DNA探针，杂交后用藕联有荧光素亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，进一步将荧光信号放大，从而可以使检测的灵敏度提高 常用检测方法在实体肿瘤应用的比较 检测方法 检测指标 优点 缺点 IHC 蛋白质 费用低光镜即可观察结果 准确性差，主观性强，假阳性率高 CISH DNA 光镜即可观察结果 对低度扩增及染色体非整倍扩增检测灵敏度下降 FISH DNA 对于低倍、高倍染色体非整倍性扩增检测准确性高，灵敏度特异性好，结果判断客观 相对费用较高　 FISH与其它染色体检测技术在实体肿瘤应用的比较 方法 检测指标 技术特点 FISH DNA 用于间期细胞样品，荧光显直接观察荧光信号，直观计数染色体靶位点拷贝数 染色体显带分析 DNA 用于中期分裂像细胞 定量PCR DNA 假阴性和假阳性比例较高，对同一样本只能作一次分析，不能重复实验结果; 制定标准曲线后方可进行基因拷贝数预测 FISH在实体肿瘤应用的目的个体化治疗方案确定肿瘤诊断预后判断 乳腺癌HER-2基因扩增检测 致癌基因：Her-2基因位点：17q11.2-q12编码蛋白：跨膜蛋白（与表皮生长因子受体部分同源）25-30%乳腺癌病人都有HER-2的扩增HER-2基因扩增是决定Herceptin是否有效的关键性指标 检测探针： GLP Her2 / CSP17GLP(位点特异性探针）CSP（染色体着丝粒探针）探针定位： Her2：17q11.2-q12CSP17: 17p11.1-q11.1标记颜色： Her2 (Red)CSP17 (Green)正常: 2R/2G异常: 红信号≥2为异常细胞(绿色信号不少于2个的细胞) 统计Ratio值（计数浸润性部分的20个细胞）Ratio值＝20个细胞核中红信号总数/绿信号总数Ratio＜1.8 为阴性结果Ratio＞2.2或众多信号连接成簇时可不计算为阳性结果比值2～4为低度扩增； 4～10为中度扩增； 10为高度扩增Ratio在1.8-2.2 之间时，则需要再计数20个细胞核中的信号，或由另一分析者重新计数。如仍为临界值，则应在FISH检测报告中注明。若基因扩增在不同癌细胞中存在差异时，应在另一癌区域再计算20个癌细胞信号比值，报告其最大值，同时加以注释　 其他可经FISH检测确定的实体肿瘤治疗方案 临床治疗 作用靶点 肿瘤种类 Gleevec（格列卫） Bcr-Abl，C-Kit酪氨酸激酶 慢性髓细胞性白血病、胃肠间质瘤 Tarceva（塔西法） EGFR 化疗耐药的非小细胞性肺癌 Iressa（易瑞沙） EGFR 晚期或转移性非小细胞肺癌 Avastin（阿瓦斯丁） VEGF 转移性结直肠癌、乳腺癌 Erbitux（艾比特恩） EGFR EGFR阳性的转移性结直肠癌；肾癌、胰腺癌、头颈部肿瘤也有效 FISH在实体肿瘤应用中的诊断意义宫颈细胞由不典型增生向宫颈癌转变过程中几乎都伴有3号染色体长臂扩增，其中涉及到的最重要的基因可能是人类染色体末端酶（hTERC）基因3号染色体长臂扩增能区分CINI与CIN II-III，特异性90%以上同时这一区段扩增提示有恶变可能，有助于宫颈癌早期诊断和风险预测检测探针：GLP TERC （Red）3q26.3CSP 3 (Green）3p11.1-q11.1 膀胱癌遗传学改变中9号染色体部分或全部丢失是最常见的遗传学特征之一，这一异常，特别是p16基因缺失与膀胱癌的早期发生密切相