SPae抑制炎癥反应和细胞泡沫化的作用及其机制研究暨支架相关Meta分析《山东大学》2014年博士论文.docVIP

KKME---专业医学搜索引擎/ SPae抑制炎症反应和细胞泡沫化的作用及其机制研究暨支架相关Meta分析--《山东大学》2014年博士论文 背景 血管的慢性炎症贯穿整个动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的发生发展过程。特别是在动脉粥样硬化早期阶段,内皮功能障碍发挥了主要的作用。在多种致病因素的作用下,血管内皮细胞活化,粘附分子、致炎细胞因子及化学趋化因子的表达增加,协助炎症细胞浸润,造成内皮功能障碍、氧化应激增加,细胞凋亡、脂质沉积,最终导致动脉硬化的发生。 转录因子κB (NF-κB)活化与动脉粥样硬化的炎症反应发生和发展密切相关。NF-κB是由P50, P52, P65, Re1B和c-Rel等五种分子组成的同源或异源二聚体并参与调控体内病理生理如免疫、炎症、增殖等过程。在细胞处于正常状态时,NF-κB的组成成分限制在胞浆中,而当细胞受到外界刺激后,NF-κB抑制因子(IκBs)被其上游的IκB激酶(IKK)复合物激活,发生磷酸化,随后被泛素化及蛋白酶体降解,最终导致NF-κB(主要是P65/P50二聚体形式)的释放并由胞浆转位至胞核,参与调控目的基因的转录及表达。 在动脉粥样硬化形成的过程中,氧化应激发挥着重大作用。氧化应激是过量的活性氧与内源性清除活性氧的抗氧化系统间失去平衡。活性氧影响血管内皮的很多功能,如介导血管内皮细胞和平滑肌细胞生长、凋亡和存活等表型调节,内皮依赖的血管扩张,参与血管壁缺失一氧化氮(NO)生物活性而损伤,增加单核细胞粘附和在血管生成中起作用。 丹皮酚磺酸钠(Sodium Paeonolsilate, SPae)是从中药牡丹皮中分离提取的丹皮酚经磺化、成盐形成的一种新的化合物,具有抗炎、止痛、抗肿瘤、抗脂质过氧化、免疫调节等多重作用,近年有研究表明其具有抗动脉粥样硬化作用,但具体作用机制仍不清楚。因此,我们观察了丹皮酚磺酸钠对血管炎症影响,并探讨其可能的作用机制。 目的 1.研究丹皮酚磺酸钠对肿瘤坏死因子α (TNF-a)诱导的单核细胞粘附分子、致炎因子及化学趋化因子受体表达的影响。 2.研究丹皮酚磺酸钠对TNF-α诱导内皮细胞的NF-κB活性、氧化应激的影响及可能的机制。 方法 1)人动脉内皮细胞1human aortic endothelial cells, HAECs)的培养 人动脉内皮细胞(himan aortic endothelial cells, HAECs)培养在含有10%FBS的ECM培养基中,置于5%C02,37℃培养箱中培养,每三天换一次液,并根据需要进行传代和铺板。 2)细胞模型的建立 HAECs与5,10和20ng/ml的fNF-α共孵育24h, Western Blot检测内皮细胞ICAM-1和VCAM-1的表达。 3)单核细胞粘附实验 用终浓度为5μmol/L的钙黄绿素-AM (calcein-AM)标记的THP-1细胞接种在HAECs上。避光条件下,37℃共同孵育2h。用PBS轻轻清洗细胞2-3次,去除未粘附的单核细胞,加入2mlPBS,于激光共聚焦显微镜下观察,激发波长485nm,发射波长530nm。 4) ROS检测 按照ROS试剂盒操作说明,运用二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)探针检测丹皮酚磺酸钠处理后,细胞内超氧化物的释放情况。 5) NO、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)检测 按照NO、SOD、LDH试剂盒操作测定一氧化氮、超氧化物歧化酶、乳酸脱氢酶。 6) Western blot蛋白检测 检测丹皮酚磺酸钠处理后,细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)的表达,磷酸化内皮型一氧化氮合酶(p-eNOS),以及NF-κB.p-IKKβ活性。 7)小鼠在体炎症模型的建立 本实验采用30μg/kg TNF-α经腹腔注射(i.p.)48h建立小鼠在体炎症模型。 8)血清中ICAM-1、VCAM-1、白介素8(IL-8)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)检测 取动脉血,按照ELISA试剂盒说明,检测血浆中ICAM-1、VCAM-1、IL-8、MCP-1水平。 免疫组化 麻醉小鼠,取出胸主动脉,蔗糖梯度溶液中脱水,石蜡包埋组织,石蜡切片机切片,主动脉按冠状切面切取厚度为4μm的组织切片,-80℃保存。按照操作步骤进行ICAM-1和VCAM-1的组织染色。 结果 1.丹皮酚磺酸钠能够抑制TNF-α诱导的ICAM-1和VCAM-1的表达,减少活性氧簇(ROS)释放,增加NO、SOD的生成。 2.丹皮酚磺酸钠上调TNF-α诱导的内皮细胞eNOS磷酸化水平和降低NF-κB活性及p-IKKβ的表达。 3.丹皮酚磺酸钠在体模型上抑制TNF-α