高效液相色谱仪的原理及应用辩析.ppt

第四章 高效液相色谱仪的原理及应用 高效液相色谱  high performance liquid chromatograph，HPLC 1)吸附色谱（液-固） 2)分配色谱（液-液） 3)离子交换色谱 4)排阻色谱（又称凝胶色谱） 2、光电二极管阵列检测器 DAD 3、荧光检测器 2、内标法 —— 标准物质在未知样内部 3、外标法 —— 标准物质在未知样外部 4、归一化法： 例3、稠环芳烃的分析 时间长、浪费溶剂 在HPLC中应用最多的是往复泵 ，这种泵使用带有往复活塞小体积泵室(35～345μL)。 流速不稳－保留时间定性？ 100米跑，拉终点线，太高检查不到有人（有东西出来却没峰…) 目前常用的检测器主要有：紫外-可见检测器 荧光检测器 电化学检测器 折光示差检测器 蒸发光散射检测器 质谱检测器 ?紫外吸收检测器是目前HPLC中应用最广泛的检测器。它灵敏度高，线性范围宽，对流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱，它要求被检测样品组分有紫外吸收，使用的洗脱液无紫外吸收或紫外吸收波长与被测组分紫外吸收波长不同，在被测组分吸收波长处没有吸收。 荧光检测器是一种专用型检测器，灵敏度在目前常用的HPLC检测器中最高，在HPLC中应用较多。仅次于紫外吸收检测器。它用于能激发荧光的化合物。 很多与生命科学有关的物质，如氨基酸、胺类、维生素、甾族化合物及某些代谢药物都可以用荧光法检测。 荧光检测器在生物样品痕量分析中很有用，尤其在用荧光衍生剂后，可以检测很微量的氨基酸和肽。 本质仍为紫外吸收检测器， 一次一个波长 一次许多个波长 气相色谱需要泵吗？ 输液系统的功能: ◆提供足够的驱动力使流动相通过填充柱 ◆使流动相流量精确和稳定 ◆使流动相组成精确 这个要注意，书上没有！ m/e HPLC-紫外 尚可狡辩 HPLC-MS … 凯氏定氮法 C3H6N6 蛋白质－全部变成氨 气体－高压溶解－低压析出 （啤酒、可乐…) IC会再讲。 提问：如何增加进样量？（加大长度、内径） 有的同学说加快流速、有用吗？ ______ 课前录像———— 色谱操作、有机制备等 依据: 被测物质的量W 与它在色谱图上的峰面积A（或峰高）成正比。—— 响应的程度、敏感度。 因为峰高比峰面积更容易受分析条件波动的影响，且峰高标准曲线的线性范围也较峰面积的窄，因此，通常情况是采用峰面积进行定量分析。 峰面积比峰高更稳定：峰高一维，S二维，H偏一点，宽度可以补回去。 组分的峰面积越大, 所占比例越大?—— 画图说明，紫外，虽然在柱子上分开了，但在检测器上未必检测得出来。 剪纸测峰面积 绝对校正因子受实验条件的影响，定量分析时必须与实际样品在相同条件下测定标准物质的校正因子。 人不能两次踏进同一条河里：样品不能两次经过同一根色谱柱。假设 电压变低、柱效下降、时间增加（画图），使 峰面积减少10％，则算出来的 fi 减小。 怎么消除呢？相对f。 S 作为参照物。不同色谱仪之间互相比较…. 选择的标准物质S可以另外进样，单独作一个色谱图；也可以加入试样中和待测样一起出图—— 内标法： 如假设 电压变低，峰面积都减少10％，则fi? 仍 ＝ … = 原。 归一化法是将所有组分的峰面积分别乘以它们的相对校正因子后求和，即所谓“归一”，被测组分X的含量可以用下式求得。 采用归一化法进行定量分析的前提条件是样品中所有成分都要能从色谱柱上洗脱下来，并能被检测器检测。 特点： 归一化法简便、准确； 进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大； 仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。 标准曲线法： 将每一个被测组分的标准物质配制成不同浓度的标准溶液，经色谱分析后制作一条标准曲线，即物质浓度与其峰面积的关系曲线。根据样品中待测组分的色谱峰面积，从标准曲线上查得相应的浓度。 A=KC 标准曲线的斜率相当于待测组分的校正因子。 所谓的外标：标准物质是在未知样外部的。标准物质可以是待测物质自己的标准物质，也可以是另外一种物质。 再简化：直接比较法—— 将未知样品中某一物质的峰面积与该物质的标准品的峰面积直接比较进行定量。通常要求标准品的浓度与被测组分浓度接近，以减小定量误差。 优点：校正检测器的响应，不需使用校正因子；只对欲分析的组分峰做校正，无需所有峰都被检测到， 缺点：进样量必须准确，仪器必须有良好的稳定性，需定期做再校正， 外标法还有简化的　直接比较法： 将未知样品中某一物质的峰面积与该物质的标准品的峰面积直接比较进行定量。要求标准品的浓度与被测组分浓度接近，以减小定量误差