水稻ERECTA基因组DNA的克隆及植物表达载体构建.docVIP

水稻ERECTA基因组DNA的克隆及植物表达载体构建 　　作者简介：韩同凯（1987-），男，硕士研究生，研究方向为作物遗传育种。 　　通讯作者：陈翠霞（1964-），女，教授，研究方向为作物遗传育种。 　　谢先芝（1972-），女，副研究员，研究方向为植物发育生物学。 　　摘要：根据水稻ERECTA的cDNA序列（GenBank中的登陆号：Os06g0203800），利用NCBI的Blast工具找到OsERECTA所对应的基因组DNA序列（gERECTA），根据该序列设计2对特异引物，对gERECTA进行分段PCR扩增，并对前后两部分片段进行克隆、测序和拼接。本研究得到的gERECTA序列为8 901 bp，其中包括约17 kb的 5′区域和约300 bp 的3′区域。将拼接起来的gERECTA序列插入到pCAMBIA1390载体，经酶切和测序鉴定，证明重组表达质粒中带有gERECTA基因片段，表明gERECTA植物表达载体pCAMBIA1390-gERECTA已成功构建。 　　关键词：水稻；OsERECTA基因；克隆；植物表达载体 　　中图分类号：Q78 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2013）06-0004-07 　　水稻ERECTA基因是植物中编码富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶基因家族（Leucine-rich repeat receptor-like kinase gene family）中的一员。Torii等（1996）[1]首次克隆得到拟南芥ERECTA基因。拟南芥ERECTA基因在顶端分生组织、植株幼嫩的或正在生长的地上部分包括生长发育中的叶片和花器官中表达，在成熟器官和根中不表达，且在植株发育早期的顶端分生组织中表达较弱，但在营养生长向生殖生长过渡阶段表达水平提高[2]。 　　随着对模式植物拟南芥ERECTA基因研究的深入，发现ERECTA基因通过协调细胞分裂和细胞增殖调节包括花在内的气生器官结构（如节间和花梗的伸长和近轴-远轴极性）和气孔模式（如气孔密度和分布）[3～6]。已有报道证明拟南芥ERECTA基因调控某些生理过程如二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）的羧化率、电子传递能力、植株的蒸腾作用和水分利用效率等[6]。且ERECTA基因在植株对生物和非生物环境如热胁迫、干旱和细菌感染的响应中起作用[6～8]。 　　尹伟伦课题组克隆得到Populus nigra×（Populus deltoids×Populus nigra）ERECTA（PdERECTA）基因并培育了转基因拟南芥植株（35S∶ PdERECTA）。PdERECTA过表达导致苗期初生根变长、叶面积变大尤其是长期水分利用率（Long-term water use efficiency）大大增强，这揭示出ERECTA基因具有提高作物水分利用率的潜在作用[9]。朱锦程等利用RT-PCR技术从拟南芥中克隆得到ERECTA基因并构建真核表达载体pBin438-ERECTA，转化番茄，结果证实转基因番茄植株的水分利用率得到提高[10]。 　　大多数高等真核生物基因都含有内含子，其转录后的序列在剪接过程中从mRNA前体上切除。但很多情况下，内含子对基因的功能是非常重要的，可能同选择性剪接有关或者内含子本身包含了重要的非编码RNAs和ORFs。内含子具有增强基因表达的作用，例如，在过渡相实验（Transient assay）中，包含内含子的玉米乙醇脱氢酶1（Alcohol dehydrogenase-1）的表达量提高了50～100倍[11]。Karve等发现拟南芥ERECTA的表达强烈依赖内含子的存在，内含子是ERECTA基因mRNA积累所必需的[12]。因此，我们推测OsERECTA基因的表达同样需要内含子存在，本研究构建了包含内含子的ERECTA基因组DNA的植物表达载体。 　　1 材料与方法 　　11 试验材料 　　111 植物材料 水稻品种日本晴（Oryza sativa L cv Nipponbare）。样品为温室中生长2周的幼苗叶片，液氮速冻后置于-70℃保存，用于全基因组DNA提取。 　　112 试验试剂 限制性内切酶、DNA Ligase、DNA片段分子量标记（λ-EcoT 14 I digest）、BAP均购于TaKaRa公司；质粒小提试剂盒购于Bioteke公司；KOD-Plus-Neo DNA聚合酶购于ToYoBo公司；DNA胶回收试剂盒、卡那霉素（Kan）、氨苄青霉素（Amp）购于上海生工生物工程有限公司。 　　113 载体及菌株 克隆载体pMD18-T Vector、pTA2-T vector购于TaKaRa公司；表达载体pCAMBIA1390（CAMBIA， Canberra， A