免疫沉淀类试验——免疫比浊试卷.pptVIP

免疫浊度测定 微生物与免疫教研室 沉淀反应（precipitation） 可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象。 分类 免疫浊度测定 概念：将现代光学测量仪器与自动化分析 检测系统相结合应用于沉淀反应，可以对各种液体介质中的微量抗原、抗体和药物及其他小分子半抗原物质进行定量测定。 （一）免疫浊度分析的基本原理： 抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物(19S)，在增浊剂(如聚乙二醇( PEG)、NaF等)的作用下，迅速形成免疫复合物微粒(19S)，使反应液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量随抗原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。用一系列已知浓度的抗原标准品同时进行试验，制备剂量反应曲线，即可计算出标本中抗原的含量 （二）类型 透射免疫比浊法 通过检测光被吸收、衍射、反射和折射后光线减弱的变化来衡量抗原抗体的复合物。 2、散射免疫比浊法 通过检测光折射和衍射而形成的散射光强度来定量抗原抗体的复合物。 3、免疫胶乳比浊法 以胶乳作为载体对小分子免疫复合物进行微量测定，进一步提高了免疫浊度测定的灵敏度。 1 透射免疫比浊法 原理： 可溶性抗原抗体在一定缓冲液中发生反应后形成的免疫复合物，使介质浊度发生改变，光线通过抗原抗体反应的溶液时，被其中的免疫复合物微粒吸收，在保持抗体过量的情况下，免疫复合物量越多，透射光越少，光线被吸收越多，用吸光度来表示。即吸光度与免疫复合物量呈正相关。可用抗原标准品建立标准曲线，测出待检抗原含量。 由于免疫复合物颗粒大小再35-100nm，对近紫外的光线可见最大吸收峰，故选择290-410nm波长测定最佳，目前多用340nm 方法评价： 优点： ① 灵敏度比单扩法高5—10倍； ② 操作简便快速，1h可报告结果； ③结果准确，且能用全自动化或半全自动化仪器进行分析，尤其随着胶乳粒子增强浊度测定法的出现，使敏感度提高，其应用更加广泛。 2 散射免疫比浊法 原理： 散射光系指一定波长的光沿水平轴照射，碰到溶液中的免疫复合物，对光线产生反射和折射而形成的。散射浊度法是在入射光的一定角度检测粒子发出的散射光，散射光的强度与复合物的含量呈正比，即待测抗原越多，形成复合物越多，散射光强度越强。又可分为速率散射比浊法(rate nephelometry)和终点散射比浊法(endpoint nephelometry)。 3 免疫胶乳比浊法 原理 是一种带载体的免疫比浊法，用抗体致敏的大小适中，均匀一致的胶乳颗粒（一般是0.2μm），在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上抗体与抗原特异性结合，引起胶乳颗粒凝集。分散的单个胶乳颗粒直径位于入射光波长之内，光线可透过，当2个或2个以上胶乳凝集时，则使透过光减弱或散射光增强。这种减少或增强的程度与胶乳凝集成正比，与抗原浓度呈正相关。 方法评价 1、敏感度高，可达到ng/L水平 2、操作简单，容易自动化 3、结果稳定、可靠，特异性好；不需特殊仪器设备，一般分光光度计、自动化生化分析仪或散射比浊仪均可使用。 (三)、主要影响因素 抗原抗体比例 抗体的质量 抗原抗体反应的溶液 增浊剂的使用 1 抗原抗体比例 高剂量钩状效应（high dose hook effect ) 海德堡（heidelberger）曲线理论 2 抗体的质量 （1）特异性高 （2）效价高 （3）亲和力高 （4）抗血清来源 3 抗原抗体反应的溶液 pH 6.5~8.5 电解质 离子强度、种类（磷酸盐缓冲液） 4 增浊剂的使用 PEG、tween-20等非离子型亲水剂 作用：消除蛋白质分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合物。 本次实验内容 免疫浊度测定 ——免疫球蛋白检测 具体步骤见说明书 思考题 免疫浊度测定的原理、方法与分类？ 影响免疫浊度测定的因素有哪些？ * * 液体内沉淀试验 絮状沉淀试验 环状沉淀试验 免疫浊度测定 凝胶内沉淀试验 免疫扩散 免疫电泳 单向免疫扩散试验 双向免疫扩散试验 火箭免疫电泳 对流免疫电泳 沉淀反应 缺点： 抗体用量较大； 检测需抗原抗体反应达到平衡，耗时较长； 溶液中存在的抗原抗体复合物分子应足够大。 灵敏度较散射比浊法低。 （a）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线； （b）结合后，则形成光线衰减 *