protocol.4.细胞培养.docVIP

细胞培养操作 一、准备工作： 75％酒精擦超净台工作台台面，摆好废液缸。 开紫外灯照射超净工作台15分钟； 关闭紫外灯后开鼓风机吹5分钟； 取出所需的培养基，PBS，胰酶、所用器械如吸管、移液管、离心管等。 戴手套，75％酒精擦拭； 二、细胞复苏（原则 缓冻速溶）： 准备37℃水浴； 从液氮中取出细胞； 迅速置37℃水浴，1min内融化； 打开培养基瓶盖（开盖前酒精棉擦拭盖口边缘），培养基瓶放在瓶架上，瓶盖放在“非工作区”，以免工作时污染； 摇出或用取物钳（用前酒精棉擦拭）取出移液管（头部不能接触任何物品）； 用移液管向培养皿（瓶）中加10ml新鲜培养基； 摇出或用取物钳（用前酒精棉擦拭）取出吸管，安上吸头，插入灭菌离心管中（吸管头部不能接触任何物品）； 用酒精棉擦拭冻存管； 开盖，将管内液吸入含10ml新鲜培养基的培养皿（瓶），摇匀。 放入CO2培养箱培养，24h后换液。 三、贴壁细胞的传代培养： 打开培养皿（瓶）盖（盖放在“非工作区”， 盖、培养皿口不能接触任何物品），倾斜吸出（可用真空泵）所有的培养基； 加入2mlPBS洗涤，倾斜吸出PBS； 加入0.5ml-1ml胰酶溶液，混匀，倾斜吸出多余胰酶，不必吸干； 37℃消化1-3分钟，倾斜培养皿看到细胞自由流动即可； 用吸管加入约4ml完全培养基，用吸管将细胞吹打下来； 将细胞悬液分配至新的培养瓶（皿）中，再用移液管加入8ml新鲜的培养基，盖盖。 收培养基瓶，盖盖； 收离心管，吸管，冲洗； 75％酒精檫台面，冲洗废液缸； 关闭超净工作台。 四、半贴壁细胞的传代培养： 同贴壁细胞的传代培养（除去2、3、4步） 五、冻存： 接贴壁细胞的传代培养中第4步（避免消化时间过长，否则会影响冻存质量）； 用移液管加2ml冻存液，用吸管将细胞吹打下来； 移入2ml冻存管（1ml/管），标记冻存管； 置于液氮液面上； 12－24h后放入液氮，记录。 另： 完全培养基：基础培养基＋小牛血清10％＋双抗溶液1％） 胰酶溶液：0.25％胰酶＋0.02％EDTA-Na2 冻存液：90％完全培养基＋10％DMSO 注： 无菌操作的关键是有可能接触细胞的任何物品不能接触到为灭菌的物品。 滴管上边棉花，不紧以免滴管不好用；也不能松，将棉花吹落。关于规范细胞存放及登记： 液氮罐共有3个，已编号。1.2放细胞，3放感受态。 冻存细胞后，需在冻存记录本上记录存放的细胞名称及冻存日期。同时，还需在306办公室电脑上（桌面）。 细胞冻存记录表 1 提 1层 25 1 2层 3层 4层 5层 备注：