蛋白质浓度的测定方法结.docVIP

一、蛋白浓度的直接测定（UV法） 这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白 质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受 到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。（1）简易经验公式??? 蛋白质浓度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor2）精确计算通过计算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通过如下公式计算最终结果：?? 蛋白质浓度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D?? 其中d为测定OD值比色杯的厚度?? D为溶液的稀释倍数紫外吸收法测定蛋白质含量实验目的】? 1. 学习紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。? 2. 掌握紫外分光光度计的操作方法。? 【实验原理】? 大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大吸收，并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。? 紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简便，测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。? 【实验材料】? 1.实验器材? 试管及试管架；50毫升容量瓶 2只；移液管；紫外分光光度计。? 2.实验试剂? (1)标准蛋白质溶液：精确配制2mg／ml的酪蛋白溶液。? (2)样品溶液：配制约0.5mg/ml的酪蛋白溶液作为未知样品溶液。? 【实验操作】? 1. 绘制标准曲线? 取7支试管按下列各表加入各试剂：? 管号? 试剂 0 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质溶液(ml) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 蒸馏水(ml) 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 蛋白质浓度(mg/ml) 0.000 0.125 0.250 0.375 0.500 0.625 0.750 试剂加完后摇匀，在紫外分光光度计上，于280nm处以0号管为对照，分别测定各管溶液的光密度值。以光密度为纵座标，标准蛋白溶液浓度为横座标，绘制出标准曲线。? 2. 测定未知样品? 取样品溶液4毫升,加蒸馏水4ml混匀，在280nm下测定其光密度值。 【实验结果】? 根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液的蛋白质含量。二、比色法蛋白浓度测定蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。 双缩脲法（Biuret法）实验原理　双缩脲（NH3CONHCONH3）是两 个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。9 L B?? P?? n! 试剂与器材# S; d( z/ I+ M( h3 C6 }???? 试剂： T! `$ d3 V, J% A（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05N NaOH配制。1 ^) ^+ }: ~1 L2 ~?? N ?6 C（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。- P( C4 v( K6 @/ {