抑制性消減杂交技术及其在动物基因研究中的应用.docVIP

抑制性消减杂交技术及其在动物基因研究中的应用 陶金忠，张　勇，杨永新，张进隆，赵兴绪* (甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070)? 摘　要：抑制性消减杂交(SSH)是结合抑制性PCR和消减杂交技术发展起来的一种高效分离差异表达基因的方法，具有特异性高、假阳性率低、操作简便、灵敏度高等特点。在两种状态下基因的表达变化、差异基因的克隆和鉴定对基因表达调控有着重要意义。SSH在动物抗病、抗应激及药物的靶基因等方面的研究中取得了重要的进展。 关键词：抑制性消减杂交；聚合酶链反应；基因；动物 抑制性消减杂交(SSH)技术是1996年Diatchenko L等[1]设计出的以抑制性PCR和消减杂交技术为基础的一种寻找差异基因的方法。与其他技术相比，具有假阳性率低、特异性高、灵敏度高、操作简便、周期短等特点，是目前最具应用前景的研究工具之一，在新基因的分离鉴定中显示了重要的价值。 1　SSH的原理 SSH是利用抑制性PCR能选择性指数扩增不同丰度差异基因和cDNA消减杂交建立起来的方法，运用了杂交二级动力学原理即高丰度序列退火时产生同源杂交的速度大于低丰度序列，使原本在丰度上有差异的DNA序列的相对含量趋于一致。然后利用抑制性PCR链内退火优于链间退火的特点，使两端接上同一接头的非目的基因片段，后者具有反向重复序列，因而在退火时易形成发卡状互补结构，在PCR中不能作为模板与引物配对扩增，从而达到选择性扩增目的基因而抑制非目的基因片段扩增的目的。消减杂交去除了试验组和对照组之间的同源序列，再结合抑制性PCR的动力学富集，能高效地分离出丰度较低的特异性非同源片段。 2　SSH的技术路线 2.1　cDNA的合成与酶切 分离纯化试验组mRNA(其中包含差异表达基因，称为Tester)与对照组(称为Driver)mRNA，分别依次合成单链cDNA(singlestrand cDNA， sscDNA)和双链cDNA(doublestrand cDNA， dscDNA)。将Tester dscDNA和Driver dscDNA分别用RsaⅠ(一种识别四碱基内切酶)酶切为最大平均长度600 bp的平头末端dscDNA片段。小片段一方面可以降低杂交过程中形成的复杂二级结构，以减少对杂交的阻碍作用，另一方面小片段的形成为单个基因的克隆提供了更好的代表性，增加差异表达基因的检出几率。 2.2　接头连接 接头1和接头2R(adaptor 1和adaptor 2R)分别是由44 bp和42 bp的长链和10 bp的短链组成的一端是平头末端的双链DNA片段，接头两端均已去磷酸基团，保证只有adaptor长链3′与cDNA片段5′连接。接头长链外侧序列分别与第一次PCR引物(PCR primer 1)相同，而接头长链内侧序列与第二次PCR两个引物(nested primer 1和nested primer 2R)相同。将酶切Tester cDNA分为两份，一份与接头1连接，另一份与接头2R连接。 2.3　消减杂交 分别向连接不同接头的Tester cDNA中加入过量Driver cDNA，在杂交液中进行第一轮杂交，杂交完毕将形成4种产物：①均一化了的差异表达的单链Tester cDNA；②自身退火的Tester cDNA ；③异源退火Tester/Driver cDNA(共有序列形成异源杂交产物)；④自身退火的Driver cDNA。第二次杂交时，将第一次两份杂交产物在新鲜变性Driver cDNA存在的条件下混合杂交，进一步去除共有序列，杂交完毕产物中形成一种特殊类型的e型分子，它是由第一轮杂交中形成的均一化了的连接有不同接头差异表达单链Tester cDNA片段退火形成。 2.4　两次选择性PCR扩增 第二轮杂交完毕，将接头补平，第一次PCR扩增时，①、④型分子无引物结合位点不能扩增，③型分子为单接头，只能线性扩增，②型分子两端接头相同，由于接头上有退火温度很高的反向重复序列，形成“锅柄”结构，受抑制PCR效应，故不能被扩增。只有目标片段形成的e型分子两端连有不同接头，以指数级大量扩增。第二次PCR扩增时，换用接头内侧引物进一步选择性扩增目标片段。 经过两轮消减杂交和两轮选择性PCR，目标片段已被大大富集。产物可以直接用于克隆构建消减文库，也可用于制作探针进行差异筛选。 3　SSH的优点 与以往种种差减杂交技术相比，SSH技术的优点主要表现在以下几个方面。 3.1　特异性高 基于杂交动力学原理的第1步杂交使不同丰度的mRNA分子趋于一致，SSH克服了不同mRNA分子拷贝数目不同对杂交结果的影响，从而大大提高了差减的灵敏度。 3.2　操作简单 SSH技术无需采用任何中间步骤分离单链或双链cDNA，仅需一轮差减杂交