生物第一DNA重组技术的基本工具.ppt

1.1 DNA重组技术的基本工具 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 基因工程产品 基础理论和技术的发展催生了基因工程 DNA是遗传物质的证明 DNA双螺旋结构和中心法则的确立 遗传密码的破译 基因转移载体的发现 工具酶的发明 DNA合成和测序技术的发明 DNA体外重组的实现 重组DNA表达实验的成功 第一例转基因动物问世 PCR技术的发明 DNA重组技术的基本工具 限制性核酸内切酶——准确切割DNA的工具， 即“分子手术刀” DNA连接酶——DNA片段的连接工具 即“分子缝合针” 基因进入受体细胞的载体——基因转移工具 即“分子运输车” 一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” 限制酶所识别的序列有什么特点 限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。 限制性内切酶 3.限制酶在原核生物中的作用 原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。 含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 二、DNA连接酶——“分子缝合针” 1.连接酶有两种： 一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E·coli连接酶。 另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。 2.这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。 3.E·coli连接酶只能连接黏性末端； T4连接酶既可“缝合”黏性末端，又可“缝合”平末端。 DNA连接酶——“分子缝合针” DNA连接酶与DNA聚合酶一样吗？为什么？ 三、基因的载体——“分子运输车” 质粒 * * * * 人类需要的基因产物 结果 剪切→拼接→导入→表达 基本过程 DNA分子水平 操作水平 基因 操作对象 生物体外 操作环境 基因拼接技术或DNA重组技术 基因工程的别名 抗虫害的玉米 转鱼抗寒基因的番茄 转基因鲑鱼 转黄瓜抗青枯病基因的甜椒 乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷) 基础理论 技术发明 分 布： 主要从原核生物中分离纯化得到 作用特点： 特异性，即识别双链DNA分子的 特定核苷酸序列，切割特定切点 切 点： 每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键 种 类： 约4000种 举 例： EcoRI限制酶能识别GAATTC序列， 并在G和A之间切开 结 果： 形成两种末端 黏性末端 平末端 限制酶 1.什么叫黏性末端？ 当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 　　DNA被限制酶切断后有两个反向互补的“黏性末端”。被同一种限制切断的几个DNA具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。 2.什么叫平末端？ 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。 答：不是一回事。（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成） （1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端 的羟基上，形成磷酸二酯键； 而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。 （2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸 二酯键形成一条与模板链互补的DNA链； 而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。 因此DNA连接酶不需要模板。 此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。 2.载体必须具备的条件： ① 能够在宿主细胞中复制并稳定地保存； ② 具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接； ③ 具有某些标记基因，便于进行筛选； （如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等 ） ④ 对受体细胞无害。 1.载体的作用： ① 将外源基因转移到受体细胞中去。 ② 利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行