western blot实验技术及常见问题探讨-珍藏版.pptVIP

湿转操作步骤： 1.起胶：将凝胶从玻璃板中取出，切除积层胶及溴酚蓝下部的分离胶，剩下的含有目的蛋白的分离胶浸泡于转膜缓冲液中，防止胶凝固、变形。 2.润湿：准备2张Whatman 3#滤纸、1张NC膜，尺寸与凝胶大小相仿（滤纸与胶一样大，膜比胶大一些）， NC膜先放入水中3分钟，再放入转膜缓冲液中10分钟。（若用PVDF膜，应先在100%甲醇中浸泡，否则很难润湿。甲醇可反复利用。） 3.三明治的制作：按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、1层Whatman 3#滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、1层Whatman 3#滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。 组装顺序：转膜夹黑色面（负极）－海绵垫－滤纸－胶－ 膜－滤纸－海绵垫－红色面（正极） 切记：每层之间用滴管/玻棒将其中的气泡全部赶出，绝不允许气泡存在！ 4.转膜：将转移夹放入转移槽，加入4 ℃预冷的转膜缓冲液，将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连。 转膜电流和时间: 一般转膜的电流在200mA-400mA之间，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。大片段的50KD的可以选用350mA,小片段的可以用250mA，上述电流均能很好的把大部分蛋白转过去。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转