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纤维素分解菌的分离和鉴定
纤维素降解菌类的分离与鉴定系列实验
一、实验背景
纤维素是植物细胞壁主要成分,属于多糖类物质,是地球上数量最大的可再生资源。如能利用微生物将其转化为生物产品或生物能源,即可缓解能源短缺、解决环境污染,又能形成新的产业。由于在自然界中存在着大量产纤维素酶的细菌和真菌,因而纤维素的生物降解主要依赖于微生物的作用。从20世纪40-50年代起,针对产纤维素酶的微生物的分离筛选就进行了大量的工作,并逐步建立起一套较完整的分离筛选方法。迄今为止有关纤维素降解菌分离筛选的研究报导已有很多,如细菌中的生孢噬纤维菌属、噬纤维菌属及纤维单胞菌属等;放线菌由于能形成芽孢,与真菌相比较耐高温和各种酸碱度,故在高温阶段放线菌对分解木质素和纤维素起着重要的作用。主要有诺卡氏菌属、链霉菌属、芽孢杆菌属及小单胞菌属等;真菌中研究较多的是青霉属、根霉属、曲霉属等,其中以木霉属的菌株纤维素酶活较高。以羧甲基纤维素钠和添加少量葡萄糖作为碳源,培养纤维素酶产生菌株,培养一定时间后,经刚果红染色和稀碱液固定,在菌落周围形成透明水解圈,根据透明圈的大小,快速定性鉴定纤维素酶产生菌酶活大小。与传统纤维素酶活检测方法比较,本方法菌丝生长快,两天后菌落经染色,透明圈边缘清晰,直观性强,与酶活力成一定线性关系。ml无菌水(带玻璃珠),含9ml无菌水的试管,无菌培养皿, 1ml及0.08ml移液管。
四、实验步骤:
(牛粪中纤维素降解菌类的分离与鉴定)
1、牛粪取样
于冰箱取2个牛粪样品各5g。
2、选择培养
(1)实验准备:将实验所需平板约60个,两个锥形瓶(各45ml无菌水加少量玻珠),14支9ml无菌水灭菌。
(2)培养基的配置:参照配方配制培养基①羧甲基纤维素钠培养基②LB培养基③高氏一号培养基。在121℃下高压灭菌20min。
(3)将2份牛粪样品于超净工作台内放入45ml锥形瓶内,即为10-1悬液,于1500r/min摇床15min。
(4)用移液枪吸取10-1悬液1ml打入9ml无菌水中,即为10-2悬液,如此重复,依次制成10-3至10-8悬液。
(5)倒平板:将灭菌后的各个培养基在无菌操作下倒20ml左右于培养基中,凝固后待用。
(6)涂布平板:将稀释度为10-6至10-8悬液各取0.08ml涂布到平板培养基上,每个梯度需涂布2个平板,设为对照。置于培养箱中培养观察,持续观察,直到出现明显的菌落。
3、挑菌保种
将出来的明显菌类按照类别分别保种到不同的斜面培养基中。
4、刚果红鉴定
配制刚果红培养基,将菌株点样与刚果红培养基上,置于培养箱培养。观察各个菌株是否具有分解纤维素的能力。
(从湿土中提取纤维素菌)
1、分别配制①羧甲基纤维素钠培养基②LB培养基③高氏一号培养基④PDA培养基各500ml,装进5个瓶子中。在14根试管中分别加入9ml蒸馏水,并用试管塞塞紧。在两个锥形瓶中分别加入45ml蒸馏水,并且放如玻璃球,用封口膜封好。包90个平板。准备1ml和0.1ml移液枪的枪头。将以上5种物品用报纸包好后放入灭菌锅中121℃灭菌30分钟。同时将操作台的紫外线打开。
2、待灭菌完后,将物品取出,放入烘箱烘干。
3、将烘干后的平板、试管、锥形瓶、枪头放入操作台里。两种湿土样分别称取5g,在操作台里加到锥形瓶中,封口,放到摇床上摇30分钟。
4、摇好后取回,关闭操作台的紫外线。取7支试管并分别标号-2、-3、-4、-5、-6、-7,用1ml移液枪从一个锥形瓶中吸取1ml菌液,射到-2号试管中,换枪头,从-2号试管中吸取1ml菌液射到-3号试管中,以此类推。另一个锥形瓶的菌液也要经过同样的操作。
5、取一个培养基(例如LB培养基),倒24个平板,立即用1ml移液枪移取一种菌液-5号试管中的液体,注射到一个平板中,摇匀(混菌法)。标号。一个菌液,一个梯度做两个平板.剩下12个平板做涂布。其他4个培养基同理。
6、待要涂布的平板干了以后,进行涂布。每个平板加0.1ml菌液,用涂布器抹匀,到看不见水印为止,将涂布完的平板倒置在超净台里。标号。一个菌液,一个梯度做两个平板。
7、将做好的所有平板,放入恒温箱中培养,每天观察有没有长菌,及时将有菌的平板挑出保种。
(从干土中提取纤维素菌)
1、土壤处理
于冰箱取3个土壤样品置于实验室中风干7天左右。
2、选择培养
(1)实验准备:将实验所需平板约90个,两个锥形瓶(各45ml无菌水加少量玻珠),21支9ml无菌水灭菌。
(2)培养基的配置:参照配方配制培养基:①羧甲基纤维素钠培养基②LB培养基③高氏一号培养基。在121℃下高压灭菌20min。
(3)将3份土壤样品于超净工作台内放入45ml锥形瓶内,即为10-1悬液,于1500r/min摇床15min。
(4)用移液枪吸取10-1悬液1ml打入9ml无菌水中,即为10-2悬
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