纤维素分解菌的分离和鉴定.doc

纤维素降解菌类的分离与鉴定系列实验 一、实验背景 纤维素是植物细胞壁主要成分，属于多糖类物质，是地球上数量最大的可再生资源。如能利用微生物将其转化为生物产品或生物能源，即可缓解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。由于在自然界中存在着大量产纤维素酶的细菌和真菌，因而纤维素的生物降解主要依赖于微生物的作用。从20世纪40-50年代起，针对产纤维素酶的微生物的分离筛选就进行了大量的工作，并逐步建立起一套较完整的分离筛选方法。迄今为止有关纤维素降解菌分离筛选的研究报导已有很多，如细菌中的生孢噬纤维菌属、噬纤维菌属及纤维单胞菌属等；放线菌由于能形成芽孢，与真菌相比较耐高温和各种酸碱度，故在高温阶段放线菌对分解木质素和纤维素起着重要的作用。主要有诺卡氏菌属、链霉菌属、芽孢杆菌属及小单胞菌属等；真菌中研究较多的是青霉属、根霉属、曲霉属等，其中以木霉属的菌株纤维素酶活较高。以羧甲基纤维素钠和添加少量葡萄糖作为碳源，培养纤维素酶产生菌株，培养一定时间后，经刚果红染色和稀碱液固定，在菌落周围形成透明水解圈，根据透明圈的大小，快速定性鉴定纤维素酶产生菌酶活大小。与传统纤维素酶活检测方法比较，本方法菌丝生长快，两天后菌落经染色，透明圈边缘清晰，直观性强，与酶活力成一定线性关系。ml无菌水（带玻璃珠），含9ml无菌水的试管，无菌培养皿， 1ml及0.08ml移液管。 四、实验步骤： （牛粪中纤维素降解菌类的分离与鉴定） 1、牛粪取样 于冰箱取2个牛粪样品各5g。 2、选择培养 （1）实验准备：将实验所需平板约60个，两个锥形瓶（各45ml无菌水加少量玻珠），14支9ml无菌水灭菌。 （2）培养基的配置：参照配方配制培养基①羧甲基纤维素钠培养基②LB培养基③高氏一号培养基。在121℃下高压灭菌20min。 （3）将2份牛粪样品于超净工作台内放入45ml锥形瓶内，即为10-1悬液，于1500r/min摇床15min。 （4）用移液枪吸取10-1悬液1ml打入9ml无菌水中，即为10-2悬液，如此重复，依次制成10-3至10-8悬液。 （5）倒平板：将灭菌后的各个培养基在无菌操作下倒20ml左右于培养基中，凝固后待用。 （6）涂布平板：将稀释度为10-6至10-8悬液各取0.08ml涂布到平板培养基上，每个梯度需涂布2个平板，设为对照。置于培养箱中培养观察，持续观察，直到出现明显的菌落。 3、挑菌保种 将出来的明显菌类按照类别分别保种到不同的斜面培养基中。 4、刚果红鉴定 配制刚果红培养基，将菌株点样与刚果红培养基上，置于培养箱培养。观察各个菌株是否具有分解纤维素的能力。 （从湿土中提取纤维素菌） 1、分别配制①羧甲基纤维素钠培养基②LB培养基③高氏一号培养基④PDA培养基各500ml，装进5个瓶子中。在14根试管中分别加入9ml蒸馏水，并用试管塞塞紧。在两个锥形瓶中分别加入45ml蒸馏水，并且放如玻璃球，用封口膜封好。包90个平板。准备1ml和0.1ml移液枪的枪头。将以上5种物品用报纸包好后放入灭菌锅中121℃灭菌30分钟。同时将操作台的紫外线打开。 2、待灭菌完后，将物品取出，放入烘箱烘干。 3、将烘干后的平板、试管、锥形瓶、枪头放入操作台里。两种湿土样分别称取5g，在操作台里加到锥形瓶中，封口，放到摇床上摇30分钟。 4、摇好后取回，关闭操作台的紫外线。取7支试管并分别标号-2、-3、-4、-5、-6、-7，用1ml移液枪从一个锥形瓶中吸取1ml菌液，射到-2号试管中，换枪头，从-2号试管中吸取1ml菌液射到-3号试管中，以此类推。另一个锥形瓶的菌液也要经过同样的操作。 5、取一个培养基（例如LB培养基），倒24个平板，立即用1ml移液枪移取一种菌液-5号试管中的液体，注射到一个平板中，摇匀（混菌法）。标号。一个菌液，一个梯度做两个平板.剩下12个平板做涂布。其他4个培养基同理。 6、待要涂布的平板干了以后，进行涂布。每个平板加0.1ml菌液，用涂布器抹匀，到看不见水印为止，将涂布完的平板倒置在超净台里。标号。一个菌液，一个梯度做两个平板。 7、将做好的所有平板，放入恒温箱中培养，每天观察有没有长菌，及时将有菌的平板挑出保种。 （从干土中提取纤维素菌） 1、土壤处理 于冰箱取3个土壤样品置于实验室中风干7天左右。 2、选择培养 （1）实验准备：将实验所需平板约90个，两个锥形瓶（各45ml无菌水加少量玻珠），21支9ml无菌水灭菌。 （2）培养基的配置：参照配方配制培养基：①羧甲基纤维素钠培养基②LB培养基③高氏一号培养基。在121℃下高压灭菌20min。 （3）将3份土壤样品于超净工作台内放入45ml锥形瓶内，即为10-1悬液，于1500r/min摇床15min。 （4）用移液枪吸取10-1悬液1ml打入9ml无菌水中，即为10-2悬