毕氏酵母(Pichia_pastoris)感受态细胞制备及转化.doc

毕氏酵母（Pichia pastoris）感受态细胞制备及转化1、毕氏酵母氯化锂转化法 （1）试剂 1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释） 50% PEG3350（Sigma P3640? 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装） 2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20保存 注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用； （2）感受态毕氏酵母的制备 接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）； 收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min； 重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管； 离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中； 按50ul/管分装，立即进行转化； 注：不要将感受态酵母菌冰浴； （3）毕氏酵母的转化 煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA； 将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液； 对于每一个转化，按以下顺序加入： 50% PEG3350????????????????????? 240ul 1M LiCl?????????????????????????? 36ul 2mg/ml 单链Salmon sperm DNA?????? 25ul 5～10ug/50ul H2O 质粒DNA????????? 50ul 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）； 30水浴孵育30min； 42水浴热休克20～25min; 6000～8000rpm离心收集酵母菌体； 重悬酵母于1ml YPD培养基，30摇床孵育； 1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30培养2～3天鉴定； 2、毕氏酵母PEG1000转化法 （1）试剂 缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol 缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35 缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35 未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70保存 注： 缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20保存; 将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）; （2）待转化毕氏酵母的制备 接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30培养2d; 挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30振荡培养过夜； 取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8； 室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次； 重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻， -70保存 （3）毕氏酵母的转化 将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率； 37水浴孵育5min，中间混合样品1～2次； 取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀； 30水浴孵育1h； 室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中； 离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中； 将所有转化液铺于选择性平板，于30孵育3～4天后，鉴定； 3、毕氏酵母电转化法 （1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备 取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37，200 rpm，16～18小时。取100ul菌液接种于200ml液体LB培养基中。 37，200 rpm，培养16～18小时。 灭菌500 ml离心管，4，4000 rpm，20 min。得菌体沉淀。弃上清，菌体用10％甘油重悬并洗涤。重复洗涤3次。 第三次离心后，弃绝大部分上清，留下约1ml 液体用于重悬菌体。 从制得得感受态细胞中，取200ul于灭菌EP管中，加入连接反应产物5ul，混匀，不要产生气泡，在冰上放置5min。 将混匀后得200ul菌液移入电击杯中。 使用电击穿孔仪进行转化，设置为电压 2500 V，