方竹种质资源遗传多样研究.docVIP

方竹和合江方竹种质遗传多样性研究 刘跃钧 陈世通2 王立平3 傅兵4 （1丽水市林业科学研究院，浙江丽水323000；2丽水九龙国家湿地公园管理处，浙江丽水 323000；3 遂昌县林业局 ，浙江遂昌323300；4丽水职业技术学院，浙江丽水323000） 摘 要：目的 建立及优化方竹和合江方竹的ISSR-PCR反应体系，分析其12个种质资源的遗传多样性。方法 采用L16（45）正交试验建立、优化ISSR-PCR反应体系，利用该体系分析12个不同种源的方竹和合江方竹的遗传多样性。结果 最佳ISSR-PCR的最佳体系为：MgCl2 2.5 mmol/ L、dNTPs 100 μmol/ L、Taq 0.8U、引物0.1μmol/ L、DNA 20ng、1×Reaction Buffer。12个供试竹种被分为两大类群，其中除方竹遂昌种源2外的其他方竹竹种亲缘关系相当接近，归为一个亚群；合江方竹杭州种源和合江方竹莲都种源归到一个小亚群中。 关键词：方竹；合江方竹；分子标记，遗传多样性；研究 寒竹属（Chimonobambusa Makino）隶属于禾本科植物，其下有八月竹、大明山方竹、寒竹、毛环方竹、武夷山方竹、永善方竹、大叶方竹、合江方竹、云南方竹等20余种。我国拥有全部种类，其主要分布在秦岭以南各省区，比较集中的地区如四川、贵州等西南各省区。 表1 寒竹属12种不同竹种采集地点 种质 代号 种名 种源 种质采集地点 1 合江方竹 丽水种源 丽水市林科院百果园 2 合江方竹 杭州种源 浙江省林科院竹种园 3 方竹 莲都种源1 莲都区城西村 4 方竹 莲都种源2 莲都区大港头镇栋头村 5 方竹 遂昌种源1 遂昌县贵阳林场 6 方竹 遂昌种源2 遂昌县三仁乡林业站附近 7 方竹 松阳种源1 松阳县竹源乡小竹溪村 8 方竹 松阳种源2 松阳县三都乡 9 方竹 松阳种源3 松阳县竹源乡后畲村 10 方竹 景宁种源 景宁县东坑镇杨斜村 11 方竹 庆元种源 庆元林场场部 12 方竹 杭州种源 浙江省林科院竹种园 由于竹子是一类生物学特性特殊的植物，以地下鞭延伸为主的无性繁殖方式，以及开花时间、空间上的不确定造成有性繁育系统的缺乏，所以在亲缘关系鉴定，遗传图谱的建立等方面都存在着很大的困难。ISSR [1](inter sample sequence repeat) 分子标记由于不受环境及发育阶段的影响，其技术已经越来越多的应用到竹类植物起源、遗传多样性、分类、系统进化及构建遗传图谱等方面的研究。 利用ISSR分子标记分析浙江省内合江方竹（C．hejiangensis）和方竹（C. quadrangularis）不同种源之间的的遗传多样性，为今后优良竹种的选育等提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料及来源 于2011年10月采集浙江省内寒竹属12种不同的种质资源（见表1）。其中10种采自丽水地区各县（市、区），2种采自浙江省林业科学研究院竹种园。采得的鲜嫩竹叶后，置于-80℃冰箱保存备用。 1.2 基因组DNA的提取 用Plant DNA Mini Kit试剂盒（OMEGA公司）抽提叶片组织的基因组DNA。利用琼脂糖胶电泳检测基因组DNA的大小及完整性，并用UV-2802S (上海洪富仪器仪表有限公司)测定基因组DNA的浓度和质量。 1.3 ISSR-PCR反应条件及程序 影响PCR结果的因素主要为：引物、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、模板DNA、Mg2+，借鉴杨本超[2]、王涛[3]的反应体系及参数，设计5因素4水平正交试验（表2）并利用正交实验进行适当优化。另外，前期的研究发现，反应体系中加入2% (v/v)去离子甲酰胺，1% (v/v)甘油，可提高PCR反应的特异性，同时使条带清晰。本研究的ISSR-PCR反应程序初步确认为：95℃预变性5min；然后95℃变性45s，50℃(退火温度随引物不同而变化)退火1min 30s，72℃延伸1min 30s，重复30个循环；最后为72℃延伸10min，4℃保存。 表2 ISSR-PCR 正交设计表 编号No． 因素和水平 Factor and level MgCl2 ( mmol/ L) dNTPs (μmol/ L ) Taq/U 引物 (μmol/ L) DNA/ng 1 1.0 100 0.2 0.1 10 2 1.0 200 0.4 0.2 20 3 1.0 300 0.6 0.3 30 4 1.0 400 0.8 0.4 40 5 1.5 100 0.4 0.3 40 6 1.5 200 0.2 0.4 30 7 1.5 300 0.8 0.1 20 8 1.5 400 0.6 0.2