植物良种繁育的遗传学基础.pptVIP

步骤： （1） 称取0.4---0.5克幼叶,分别置于相应的研钵中，并加充足的液氮（一般分三次加）研磨，直至成粉末状。 （2） 迅速将粉末转入2mL离心管中，加入CTAB缓冲液[100mmol/LTrisHCI(pH8.0),1.4mol/LNaCI,50mmol/LEDTA,2%CTAB]1200μL,20%pvp140μL,β-巯基乙醇40μL（现加现用），充分混匀。 （3） 65℃水浴30分钟，水浴过程中充分混匀，晃动2—3次。 （4） 冷却至室温，常温离心12000rmp 10min （6） 取上清液（约1000μL），置2mL离心管中，加入等体积氯仿-异戊醇[1/24（v/v）]，倒转离心管数次，混匀。 （7） 置于65℃水浴 5分钟，水浴过程中倒转晃动一到两次。 （8） 冷却至常温，12000rpm离心10min （9）?取上清液，置2mL离心管中，加入等体积氯仿-异戊醇[1/24（v/v）]，倒转离心管数次，混匀。 （10）??? 常温离心12000rmp 10min （13） 取2μL的离心管，加入1mL70%的乙醇，将DNA挑入其中，晃动洗涤1--2次。倒掉70%乙醇，加入1mL无水乙醇洗涤一次，倒掉无水乙醇。超净工作台，至乙醇挥发干净。 （14） 加入650μL高盐溶解DNA。 （15） 待DNA完全溶解后，加入4μLRNA酶。37℃水浴40分钟。 （16） 加入2×体积的无水乙醇，1/10体积的NaAc(pH5.0),置冰上，跳出DNA于0.5mL的离心管中。用70%乙醇，无水乙醇各洗涤一次，置超净工作台干燥。加入50μLTE[10mmol/LTris—HCI(pH8.0)， 1mmol/LEDTA(pH8.0)]溶解DNA。 （17） 将DNA样分装，一份加入2×V无水乙醇，于-70℃长期保存在；；一份溶于TE中-20℃保存，用于近期研究 （11） 重复（9）--（10）步1—2次。 （12） 取5mL离心管，将上清液（约650μL）转入其中。加入2×上清液体积的无水乙醇，轻轻的旋转试管，试管中即有棉絮状DNA出现 1.4.2 SDS法 原理： 利用高浓度的SDS，在较高温度（55-65 ℃ ）条 件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出 核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白 质及多糖杂质沉淀,最常用的是加入5mol/L 的KAC于 冰上保温，低温条件下KAC 与蛋白质及多糖结合成不 溶物），离心除去沉淀后，上清中的DNA反复用酚/氯 仿抽提，用乙醇沉淀水相中的DNA。 试剂 　　1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 　　2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。　　3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 　　4、 RnaseA母液　　5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 操作步骤：　　1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。 　　2. 幼叶0.5-1g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。 　　3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 　　4. 室温下5000rpm离心5分钟。 　　5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 　　6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。  7. 如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。 　　8. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟, 上清液倒入干净的5ml离心管。 　　9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤)。 　　10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。 　　11. 用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。 　　12. 将DNA重溶解于1ml