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Western blot 试剂配制 1）1M1MTirs-basePH8.0：6.05gTris-base溶于双蒸水40ml中，用盐酸调PH为8.0，在用双蒸水定容至50ml。 2）17.4mg/mlPMSF：0.0174gPMSF 溶于1ml异丙醇中，-20℃保存。注：PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸和，吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。PMSF在水溶液中不稳定，应在使用前从贮存液中现用现加入裂解缓冲液中。 3）1.5M Tris-base PH8.8：36.33gTris-base 溶于60ml双蒸水中，调PH为8.8，再加入双蒸水定容至200ml。 4）1.0M Tris-base PH6.8：24.22gTris-base 溶于60ml双蒸水中，调PH为6.8，再加入双蒸水定容至200ml。 5）10%十二烷基硫酸钠（SDS）：SDS 10g溶于60ml双蒸水中，68℃助溶，再加入双蒸水定容至100ml，注：由于SDS溶解时会产生很多泡沫，定容时应先定容至95ml，等泡沫散去，在定容至100ml。 6）30%Acry/bis：29g丙烯酰胺，1g甲叉丙烯酰胺，双蒸水60ml，37℃助溶，然后定容至100ml，-4℃保存。注：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺时应戴手套和口罩，配制该溶液时应在通风橱中进行，操作过程中应穿好实验服，注意防护。 7）5×SDS凝胶上样缓冲液（Loading Buffer）： 1MTris-base PH6.8 丙三醇（甘油） SDS 溴酚蓝 1.25ml 2.5ml 0.5g 0.025g 用双蒸水定容至5ml，小分（1ml）分装后，于室温保存，使用前将50ulβ-巯基乙醇加入每小份中，加入β-巯基乙醇Buffer可在室温中保存一个月，使用时稀释为1×工作液。 8）TBST缓冲液： Tris-base Nacl Tween-20 2.42g 8.8g 500ul 用双蒸水定容至1000ml，调PH为7.4，于4℃保存。 9) 10%过硫酸铵（APS）：0.1gAPS溶于1ml双蒸水中，4℃保存一星期有效，最好现配现用。 10) 10%浓缩胶（7.5ml/两块胶）： 双蒸水 1.5MTris-base PH8.8 10%SDS 30%Acry/bis（毒） 10%过硫酸铵（APS） TEMED（毒） 3ml 1.875ml 75ul 2.475ml 75ul 3ul 依次加入上述试剂后充分混匀，现配现用，为有毒试剂注意防护。 11）5%浓缩胶（5ml/两块胶）： 双蒸水 0.5MTris-base PH6.8 10%SDS 30%Acry/bis（毒） 10%过硫酸铵（APS） TEMED（毒） 2ml 0.5ml 40ul 0.5ml 30ul 4ul 依次加入上述试剂后充分混匀，现配现用，为有毒试剂注意防护。 12) 电泳缓冲液： Tris-base 甘氨酸 SDS 1.515g 9.4g 0.5g 用双蒸水定容至500ml，由于SDS溶解过程中会产生泡沫，因此定容之后再加，现配现用。 13）转移缓冲液： Tris-base 甘氨酸 甲醇 SDS 3.03g 14.4g 200ml 0.3g 制胶完成后配制，用双蒸水定容至800ml，然后放入4℃冰箱预冷，使用时再加入200ml甲醇。 14）5%牛奶封闭液：1.5g伊利脱脂奶粉，30mlTBST，4℃保存，最好现配现用。 组织蛋白提取 1）打开4℃低温高速离心机，预冷。 2）把六孔板取出，弃上清，用预冷的PBS洗两遍，然后加入1mlPBS，用细胞刮棒将细胞刮取，1000rpm，离心5min，弃上清。 3）每孔加适量的裂解液，冰上裂解15min，每隔5min混匀一次。 4）1,2000r/min，4℃离心15min，取上清即为总蛋白，放入-80℃保存。 （胞浆胞核蛋白提取见试剂盒说明书） 蛋白灭活 根据浓度计算出上样50ug蛋白所需体积分装于0.5mlEP管中，然后加入1/4体积的5×SDS凝胶上样缓冲液，95℃高温煮沸5min，-80℃保存，最好现配现用，可临时于-20℃保存。 Western blot操作过程 制胶：将制胶板固定好，按上述方法配好分离胶，充分混匀后倒入制胶板中，确保胶不漏，然后用双蒸水封闭，室温静置30-50min（配制电泳缓冲液及转移缓冲液），凝固后倒出双蒸水，用滤纸吸干，配置好浓缩胶，倒入制胶板中，然后插入梳子，室温静置30-50min（灭活蛋白）备用。 电泳：组装好电泳仪，红对红黑对黑，从密封的中间区域倒入电泳缓冲液，至漫过周边下方的金属丝，然后拔出梳子，加入蛋白样品及蛋白Mak