第二章香蕉植株中的镰刀菌分离与鉴定.doc

第二章 香蕉枯萎病菌的分离与鉴定 1 材料 供试材料：香蕉的病株与无症株采自漳州永北村。 供试化学试剂与仪器：75 %酒精，1 %升汞，链霉素，甘油，尿素提取缓冲液（7 moL·L-1 Urea，50 mmoL·L-1 Tris-HCl pH 8.0，62.5 mmoL·L-1 NaCl，20 % SDS），苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1v/v/v），3 moL·L-1 NaAc溶液（pH 5.2），匀浆器，冻存管，显微镜，冰箱培养基：PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）：马铃薯200 g葡萄糖20 g琼脂17-20 g水1000 mL。 2 方法 2.1 香蕉枯萎病症状观察 在漳州永北村，观察病、无症株的香蕉植株发病情况及症状。 2.2 真菌的分离 采用常规的组织分离法进行病菌的分离(方中达，1998)。即选无症株(HB)与病株(DB)各1株，各取5个样品，分别为根部(R)，球茎（与根相连部位，记为S1）、假茎基部（距S1 15 cm处，记为S2）、假茎中部（株高的二分之一处，记为S3）、假茎顶部（记为S4）,分别称重。 经75 %酒精消毒2 s，再用0.1 %升汞消毒2～3 min，取出用无菌水漂洗3遍，加入无菌水100 mL，用匀浆器制成匀浆。每个样品选择两种稀释度，各吸取0.2 mL至含终浓度为200 ug·mL-1链霉素的PDA上，均匀涂布，在25 ℃的培养箱中培养3 d。每个稀释度次重复。采用平板菌落计数法统计单菌落数，计算各样品组织每克鲜重的含菌量，且分析无症株与病株植株体内的香蕉枯萎病菌的分布状况。 2.3 枯萎病原菌的纯化与保存 分别从无症株及病株的不同取样部位分离平板上挑取单菌落上的菌丝体，接种到PDA培养基平板上，25±1.5 ℃纯化培养。二次纯化培养后，采用稀释法进行单孢分离，扩大培养。将病菌孢子悬液和20 %灭菌甘油混和，装入灭菌冻存管中，充分振荡均匀后，立即放置于-80 ℃冰箱中长期保存。 2.4 香蕉枯萎病菌的鉴定 2.4.1 形态鉴定 病原鉴定依据Booth（1971）的鉴定方法：单孢分离纯培养物，接在PA培养基上，25 ℃培养4 d，测定单孢菌落的生长速度，取培养15 d的培养物进行孢子形态及产孢细胞观察，测量各类型分生孢子长度宽度。 2.4.2 分子鉴定 2.4.2.1 尿素法提取基因组DNA（曹文波等，2008；可小丽等，2008） （1）称取150 mg的菌丝样品于1.5 ml灭菌离心管中研磨，加入800 μL尿素提取缓冲液[7 moL·L-1 Urea，50 mmoL·L-1 Tris-HCl （pH 8.0），62.5 mmoL·L-1 NaCl，20 % SDS]摇匀后加入12000 r·min-1离心5 min吸取上清液12000 r·min-1再离心5 min； （2）将上清液移入到另一个新离心管中，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）溶液，用力震荡混匀，12000 r·min-1离心5 min； （3）取上清液到另一个新离心管中加入等体积的异丙醇和1/10体积的3 moL·L-1 NaAc溶液（pH 5.2），-20 ℃放置20 min； （4）12000 r.min-1离心5 min，弃上清，倒置使管壁液体流尽； （5）加70 %乙醇漂洗两次DNA沉淀，r.min-1离心1 min，弃上清，室温风干挥发乙醇。加入50 μL灭菌水溶解，放置4 ℃冰箱过夜溶解； （6）-20 ℃保存。 2.4.2.2 rDNA-ITS区扩增 (1) 镰刀菌PCR鉴定（王晓英） PCR反应体系（20 μL）：含有1个单位的Taq酶，10 × buffer 2 μL，dNTP 0.4 μL，10 μmoL·L-1的Fu3 Fu4各0.5 μL，ddH2O 15.8 μL，DNA模板1 μL。 PCR扩增条件：94 ℃变性5 min；33个循环：94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s；最后72 ℃延伸10 min。 电泳：配制1.5 %琼脂糖凝胶，取5 μL PCR产物与1 μL DNA载样缓冲液混匀上样，在1 × TAE缓冲液中电泳约1 h。用凝胶。 镰刀菌鉴定的特异性引物： Fu3：/-CCG AGT TTA CAA CTC CCA AA-3/ Fu4：/-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3/ (2) 尖孢镰刀菌PCR鉴定（Nel et al.,2006） PCR反应体系（20 μL）：含有1个单位的Taq酶，10 ×Buffer 2 μL，dNTP 0.4 μL,引物FOF 1 μL，引物FOR 1 μL， ddH2O 14.4 μL，模板 1 μL。 PCR扩增条件：94 ℃变性60 s；25个循环：94 ℃变性60