RT-PCR及其产物电泳分析20161101.pptxVIP

RT-PCR及其产物电泳分析 中南大学生命科学学院实验目的熟悉RT反应的原理；掌握RT反应的操作步骤熟悉PCR反应的原理掌握PCR反应的操作步骤以及PCR反应参数的选择与优化掌握PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测方法实验原理RT反应：在逆转录酶作用下，以mRNA为模板合成cDNA（complementary DNA）分子的过程。 PCR反应：PCR扩增是模拟天然DNA复制过程，利用DNA聚合酶在体外扩增一对引物之间特异性DNA片段的方法。其主要热循环过程可分为三个步骤：（1）变性；（2）退火；（3）延伸 。RT-PCR: 以RT反应产物cDNA分子为模板进行特异性PCR扩增的过程，是检测基因表达最常用的方法。RT反应试剂（1）引物： Oligo(dT)16，寡聚胸甘酸16个，要求mRNA有poly(A)尾巴（mRNA 1-4%）（2）逆转录酶 ： 鼠白血病病毒莫洛尼株 （MMLV）、鸟类成髓细胞瘤病毒（AMV ）（3）RT反应缓冲液：常用5×浓度。（4）底物：即四种dNTP的混合物溶液，常用10×浓度（2 mmol/L或2.5 mmol/L）。（5）模板（6）RNasinPCR反应试剂（1）引物：一对，单链的10-30nt长的DNA片段。（2）Taq DNA聚合酶（3）PCR反应缓冲液：常用10×浓度，一般组成为15mmol/L MgCl2、250mmol/L KCl等。（4）底物：即四种dNTP的混合物溶液，常用10×浓度（2 mmol/L或2.5 mmol/L）。（5）模板RT-PCR原理主要仪器微量移液器凝胶成像系统热循环仪台式微量离心机 电泳仪 电泳槽实验步骤（1）标记一个洁净的1.5mL反应管，向其中依次加入： RNA溶液5 μL RT mix 15 μL 20 μL （2）盖紧管盖，轻轻混匀后，离心 30 s，使反应成份均匀富集于管底。（3）42 ℃水浴30 min 。RT mix的成分：RNasin、5×RT反应缓冲液、2.5mM dNTPs、Oligo(dT)16、逆转录酶(MMLV) 实验步骤（4）标记一个洁净的200μL反应管，向其中依次加入：ddH2O 6 μL2×PCR mix 10 μLPrimer mix 2 μLcDNA模板 2 μL 20 μL（5）混合均匀后，离心30S，使反应成份均匀富集于管底。PCR mix的成分：PCR反应缓冲液、2.5 mM dNTPs、Taq DNA聚合酶实验步骤（6）在PCR仪上设置反应循环参数: 本次实验为：94 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，循环数为26，最后于72 ℃充分延伸5 min后，终止反应。（7）置反应管于PCR仪上进行热循环。（8）反应完毕后，取5 μLPCR产物，于1.5 ％琼脂糖凝胶电泳检测结果。注意事项1. 戴手套操作，避免污染。2. 尽量冰上操作。3. 取样准确，体系正确。4. 一定要有内参。 PCR平台期 PCR扩增有限性-平台期 经过一定数量的循环后，随着产物的对数累积趋于饱和，DNA分子数不再呈指数积累，而是进入线性增长期或静止期，此过程称为平台效应。PCR的离子需要 Taq酶活性对Mg2+浓度和单价离子（K+或NH4+）的性质和浓度较敏感。 一般PCR反应中MgCl2浓度在2.0mmol/L时酶活性最高，Mg2+浓度偏高，酶活性反受抑制。 变性剂的加入有助于模板变性，消除复杂二级结构，但不同变性剂及浓度对酶活性损害程度不同。PCR引物用量 一般PCR反应引物的终浓度为0.2～1μmol/L，在此范围内，PCR产物量基本相同。 但引物低于0.2 μ mol/L时，则产量降低。 引物浓度过高会促进引物错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成。结果分析观察结果：① 是否有扩增产物。②如有拖尾或有几条区带,说明有非特异性扩增。③分子量标准电泳后区带是否分开。④与分子量标准比较，PCR产物的长度是否正确。⑤PCR产物的产量。⑥引物二聚体。M 1 2 3 图1 PCR产物检测的琼脂糖凝胶电泳M：100bp 梯级DNA分子量标志物；泳道1：阳性对照；泳道2：靶DNA扩增；泳道3：阴性对照RT-PCR检测人β-actin基因表达（扩增产物长度 260 bp）问题及解决方法 无PCR产物 1. 确保mRNA无降解。 2. 确保酶未失活。 3. 确保引物无降解。 4. 重新设置退火温度。 5. 重新设置变性温度。 问题及解决方法 PCR产物呈拖尾现象 1. 提高退火温度。 2. 减少Taq DNA聚合酶的用量。 3. 试用二