实验五金黄色葡萄球菌检测概述[参考].pptVIP

A.4 Baird－Parker琼脂平板 A.4.1 成分 胰蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 5.0 g 酵母膏 1.0 g 丙酮酸钠 10.0 g 甘氨酸 12.0 g 氯化锂（LiCl·6H2O） 5.0 g 琼脂 20.0 g 蒸馏水 950 mL pH 7.0±0.2 A.4.2 增菌剂的配法 30%卵黄盐水 50 mL 与经过除菌过滤的 1%亚碲酸钾溶液 10 mL 混合，保存于冰箱内。 A.4.3 制法 将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节 pH。分装每瓶 95 mL，121 ℃高压灭菌 15 min。 临用时加热溶化琼脂，冷至 50 ℃，每 95 mL 加入预热至 50 ℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂 5 mL 摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过 48 h。 称取本品63 克,加入950ml蒸馏水中,加热煮沸溶解，分装,121℃高压灭菌15分钟备用。冷至50℃，每95ml加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌液(04-025)配套试剂（用法与用量见配套试剂说明）。摇匀后倾注平皿。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h） 四、实验内容 （一）、增菌培养法 样品处理→→选择性增菌→→选择性平板分离→→血浆凝固酶试验鉴别→→结果报告 第一天 样品处理和增菌培养 （一）、样品处理 固体或半固体食品：以无菌操作称取25g样品，放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌均 质杯内，于8000r/min均质1～2min，制成1:10样品匀液。 　　液体食品:：用灭菌吸管吸取25mL样品，放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内 (瓶内预置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇制成1:10样品匀液。 （二）、增菌培养 接种操作：吸取5mL稀释液接入7.5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中。37°C培养24小时。 培养：放于36±1℃培养24h。 培养结果：在NaCl肉汤中呈混浊生长，胰蛋白胨肉汤中有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长。 第二天 接种选择性平板进行分离培养 （一）、接种选择性平板 取增菌液1环，划线接种于血平板或B－P平板。 （二）、培养 放于36±1℃培养24h。 第三天 观察分离结果、镜检、做血浆凝固酶试验 （一）、观察分离结果 结果：金黄色葡萄球菌，在血平板上呈：金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周围有溶血圈；在Baird-Parker平板上：菌落为圆形，直径2-3mm，颜色灰或黑色，周围有一浑浊带，在其外层有一透明圈。 （二）、革兰氏染色、镜检 操作：革兰氏染色→镜检 结果：金黄色葡萄球菌，革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列无芽胞，直径0.5-1μm。 （三）、结果报告： 综合形态特征，血平板情况以及血浆凝固酶试验结果，判别检样有否金黄色葡萄球菌作出报告。 金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验 　　取肉汤培养物0.5mL同0.5mL凝固酶试验兔血浆于试管内充分混合,置 36±1℃培养,定时观察是否有凝块形成,至少观察6 h,以内容物完全凝固,使试管倒置或 倾斜时不流动者为阳性。 1支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作阳性对照， 另1支加入营养肉汤或0.9％无菌氯化钠溶液0.5ml作阴性对照。 阳性和阴性对照 血浆凝固酶试验 (1)取洁净玻片一张，于两端各加兔血浆一滴。 (2)用接种环取金黄色葡萄球菌苔一环，在玻片一端兔血浆中研磨混匀，接种环灭 菌后再取白色葡萄球菌苔一环，在另一端兔血浆中研磨均匀。 (3)观察兔血浆有无凝集现象。 四.检验和控制1．金黄色葡萄球菌的检验　　样品处理：无菌取25g或25mL食品样品，放入225mL灭菌生理盐水中均质，制成10-1稀释液。　　增菌培养：将10-1稀释液接入7.5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中，37°C培养24小时。　　分离培养：将上述稀释液或培养液分别划线血平板和Baird-Parker平板，置37°C培养24-48小时。金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker平板上菌落为圆形，直径2-3mm，颜色灰或黑色，周围有一浑浊带。 　　染色观察：从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列无芽胞、荚膜，直径0.5-1μm。　　血浆凝固酶试验：吸取0.5mL兔血浆与0.5mL金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤24小时培养物充分混匀，置36±1°C培养，每隔半小时观察一次，连续观察6小时，出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不流动，判为阳性。同时做阴阳性对照。　　耐热核酸酶试验：将24小时肉汤培养物沸水浴处理15min，用接种环划线刺种于甲苯胺兰-DNA平板，36±1°C培养24小时