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细胞生物学实验 细胞骨架组分的荧光染色观察 一、实验目的1、掌握细胞骨架的显示方法2、掌握荧光显微镜的使用方法3、了解荧光显微镜下细胞骨架的基本形态结构4、了解荧光探针Hoechst 33342（Ho.33324）与细胞成分的结合特性和光谱特性二、实验原理1、微丝股价是一种高度动态的三维网状结构，与细胞的多种生理活动如细胞运动、胞质分离、细胞器的定位、细胞内物质的运输、吞噬作用、细胞极性生长等密切相关。2、鬼笔环肽(phalloidin) 是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反, 只与聚合的微丝结合, 而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后, 抑制了微丝的解体, 因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。3、由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白, 因而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响. 此外, 较高浓度的鬼笔环肽对细胞有毒害作用. 因此, 用鬼笔环肽标记微丝并不是用于研究活体细胞的理想方法。三、实验材料1、材料：CHO（中国仓鼠卵巢细胞）2、试剂： （1）PEM：50mM pipes (pH6.9), 5mM EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇 （2）0.5% Triton X-100溶于PEM缓冲液中。 （3）4%多聚甲醛溶于PEM缓冲液中。四、实验步骤1、取出上次实验爬片于小盖玻片上的CHO细胞；2、取出培养有CHO细胞的盖片，于小平皿中37℃预温 PEM洗3次(每次 1mL)；3、37℃预温 4%多聚甲醛固定细胞15min (1mL)4、37℃预温 PEM洗3次5、加入0.5%Triton X-100处理约10min(1mL)；6、取一洁净的载玻片，按照其的大小在其上放置一条封口膜，在封口膜上滴加20μL 60nM Alex -phalloidin 10L湿盒中室温染色30min；7、在parafilm 膜上加PEM ，待盖玻片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片；8、37℃预温 PEM洗数3次；9、滴加10L Ho.33342复染色；10、荧光镜下观察。【注意事项】1、注意不要弄碎盖片，分清细胞所在面；2、各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落；3、荧光观察注意避光操作4、节约试剂。五、实验结果图一：CHO细胞微丝荧光染色图图二：CHO细胞细胞核荧光染色图图三：CHO细胞微丝与细胞核荧光染色叠加图六、实验结果分析染色后微丝呈绿色，细胞核为蓝色，染色较为清晰。但细胞数量较多，导致有些染色结果重叠。七、思考题1、PEM缓冲液的作用是什么？细胞内的微丝在含有ATP和Ca2+及低浓度的Na+，K+等阳离子溶液中，趋于解聚成G-actin；而在Mg2+和高浓度的Na+，K+等阳离子溶液中，G-actin则装配为F-actin。PEM缓冲液提供高Mg环境，让单体肌动蛋白（G-actin）聚合成丝状肌动蛋白（F-actin）。同时，EGTA能螯合Ca2+，使G-actin装配成F-actin，微丝骨架保持聚合状态且较为舒张。用PEM缓冲液处理细胞，能够模拟体内环境并提高细胞骨架的稳定性。2、0.5%Triton X-100处理细胞的作用是什么？0.5%Triton X-100处理细胞的作用是溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，增加细胞膜的通透性，使荧光染料能够更容易地透过细胞膜与F-actin特异性结合。3、鬼笔环肽用于细胞骨架研究的优缺点是什么？（1）鬼笔环肽用于细胞骨架研究的优点：鬼笔环肽的分子量小，很容易通过细胞，不需要对细胞进行冷丙酮和TRITON X-100处理。鬼笔环肽可以与聚合的微丝结合，通过让这种毒素吸附于荧光染料上面，可以研究细胞的内部工作机制，窥视细胞如何分裂。（2）鬼笔环肽用于细胞骨架研究的缺点：对细胞有毒性，价格昂贵。参考文献：细胞生物学实验(桑建利, 谭信)