基因定点突变技术解释.ppt

2、寡核苷酸引物诱变 使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成DNA子链的一个组成部分，因此所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列 3、重叠延伸介导的定点诱变 4、大引物诱变法 首先用正向突变引物（M）和反向引物（R1），扩增模板DNA产生双链大引物（PCR1），与野生型DNA分子混合后退火并使之复性，第二轮PCR中加入正向引物（F2），与PCR1中产生的一条互补链配对，扩增产生带有突变的双链DNA。由于F2中的退火温度显著高于第一轮PCR所使用的引物M和R1，因此，可忽略引物M和R1在本轮反应中所造成的干扰。 基因定点突变技术 目录 一、定点突变简介 二、基因定点诱变 三、基因定点突变应用 四、展望 一、定点突变简介 定点突变（site-directed mutagenesis）技术可以有目的性地在已知ＤＮＡ 序列中取代、插入或缺失一定的核苷酸片段，可以有目的或针对性的改变ＤＮＡ序列中的碱基次序；它不仅可以用来阐明基因的调控机理，也可以用来研究蛋白质结构与功能之间的关系。 　　 定点突变技术通过寡核苷酸盒式诱变、寡核苷酸引物介导、重叠延伸介导和大引物诱变法介导（PCR介导）等途径来实现。盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列，该法虽简单易行，但成本较高。寡核苷酸引物介导是利用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动对ＤＮＡ分子的复制，该方法虽被广泛应用于基因调控、蛋白质功能与结构之间的相互关系的研究中，但存在突变效率低的问题；重叠延伸和大引物诱变法介导的定点突变技术为基因修饰、改造也提供了另一条方便的途径。但该方法后续工作比较复杂，且易发生其他突变； 1、寡核苷酸盒式诱变 （Cassette mutagenesis） 利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相应序列。 将待突变的目的基因插入M13噬菌体载体上，制备单链DNA 将合成的寡核酸片段与单链模板退火，在DNA聚合酶的作用下合成互补的双链DNA 将双链DNA转化大肠杆菌，获得突变基因 突变体的筛选：寡核酸探针杂交筛选法 首先将模板DNA分别分别与引物对1（正向诱变引物FM和反向引物R2）和2（正向引物F2和反向诱变引物RM）退火，通过PCR1和2反应扩增出两种靶基因片段。FMR2和RMF2片段在重叠区发生退火，用DNA聚合酶补平缺口，形成全长双链DNA，进行PCR3扩增。最后，用引物F2和R2扩增出带有突变位点的全长DNA片段（PCR4)。 PCR介导的定点突变的优势 1、突变体回收率高，有时不需要进行突变体筛选； 2、能用双链DNA作为模板，可以在任何位点引入突变； 3、可以在同一试管中完成所有反应； 4、快速简便，无需再噬菌体M13载体上进行分子克隆。 三、基因定点突变应用 　　近年来，由于突变技术使得人们可以按照自 己的意愿改造基因或蛋白质的产物，从而取得改 变后的产物，使其造福于人类。因此突变技术已 广泛应用在各个领域，具有着广阔的应用前景。 分为： 1、突变技术在蛋白质工程中的应用 2、ＤＮＡ缺失改造 1、突变技术在蛋白质工程中的应用 　　 突变技术在蛋白质工程中的应用非常广泛和成功。此技术不仅是蛋白质定向改造的强有力工具，而且也是研究蛋白质结构和功能关系的重要方法。 在农业方面： 利用基因某一位点的改变进而来改变蛋白质的一级结构，以此来改良或改造毒蛋白的活性。同时，还可以利用突变技术改变结构域中的氨基酸残基，使突变毒蛋白与新的昆虫受体相结合来扩大杀虫的范围，可以取代具有有机磷污染 民用杀虫剂。 在酶工业方面：　 一般通过定点突变技术获得突变的酶的稳定性效果不显著，因为酶的稳定性与活性有关。从酶的稳定性与影响酶活性的条件相关性我们可以得出：蛋白的变性是由高温、极端ｐＨ、有机溶剂或去污剂的存在诱导而产生的。基于这些理论，有利于人们选择高稳定性的突变体来改变酶的结构和功能。 在医药方面： 通过在蛋白质工程中使用定点突变技术，筛选影响抗生素耐性增强的突变子，对于研发更高效的抗生素具有非常重要的指导意义。 ２、ＤＮＡ缺失改造 　　 心钠素（ＡＮＰ）和干扰素（ＩＦＮ）在临床上有着非常诱人的应用前景。这两产物在大肠杆菌和酵 母系统中都能以融合蛋白的形式表达出来。但由于在克隆过程中不可避免地引进了一些没有用的核苷酸序列，这样表达出来的产物就与天然产物存在着一定的差异。为了使克隆表达的产物与天然的产物