现代生物技术综合实验解读.ppt

现代生物技术综合实验（生技11级） 周玉萍 短号：662138 本课程实验项目（54学时） 实验1、质粒DNA的制备与质量鉴定 （包含琼脂糖凝胶电泳） 实验2、质粒DNA的片段化与分离 实验3、大分子DNA的制备和质量鉴定 实验4、PCR反应 实验5、PCR产品纯化及克隆 实验6、感受态细胞制备及转化 实验7、利用不同的方法筛选和鉴定转化子 （综合设计实验，18学时） 实验一 质粒DNA的制备与质量鉴定 一、实验目的 学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。 二、实验原理 在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会完全分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA 又恢复到原来的构型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物，通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中，再用酚/氯仿处理，可去除残留蛋白质，混杂的RNA可用RNA酶(RNAase)消除。 三、实验材料与主要试剂 实验材料： 含pEGFP质粒的大肠杆菌DH5α 主要试剂： 溶液I：50 mM葡萄糖，10 mM EDTA， 25 mM Tris-HCl（pH8.0），用前加溶菌酶4 mg/L 溶液II： 0.2 mol/L NaOH溶液（内含1% SDS）,现配现用 溶液III（pH4.8）: 60 mL 5 mol/L醋酸钾，11.5 mL 冰醋酸， 28.5 mL H2O； 饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）、酚/氯仿（1:1，V/V） TE缓冲液（pH8.0）: 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA， 含RNA酶（RNaseA）: 20 μg/ml 醋酸钠（pH5.2）、70%乙醇、无水乙醇 四、实验步骤 1) 吸取1.4 ml菌液至1.5 ml离心管中。 2) 离心(8 000r/min，1min)，弃上清液（根据菌液浓度判断是否需要重复1~2次）。 3) 加入150 μL 溶液Ⅰ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。 4) 加入200 μL溶液Ⅱ，加盖后温和颠倒5~6次，直至呈透明状。此步骤在5分钟内完成。 5) 加入150 μL预冷的溶液Ⅲ，加盖后反复颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，冰浴5min。 6) 离心(14 000r/min，5min)，移取上清液于另一干净离心管。 7)向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min，5min)，溶液将出现分层。 8) 移取上层水相溶液（约450~500μL）于另一干净离心管，加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min，5min)，溶液将出现分层。 9)移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的醋酸钠（pH5.2）和2倍体积无水乙醇混匀，冰浴30min。 10) 离心(14 000r/min，10min，4℃)，倒掉上清液。 11) 加0.5 ml 预冷的70% 酒精振荡，洗DNA沉淀一次，离心5 min，倒掉上清液。 12)真空抽干或室温自然干燥. 13)加20~30μL TE缓冲液使DNA完全溶解，室温放置10min，降解RNA杂质，少量用于琼脂糖凝胶质量检测，剩余质粒-20℃保存备用。 14) 1%琼脂糖凝胶配制：称取1g琼脂糖粉末，加入100ml 0.5倍TBE溶液，加热熔化，稍降温后，加入5μL溴化乙锭（EB），混匀，制备凝胶板，冷却后备用。 15) 每位同学各取5μL质粒DNA加入1μL 6×loading buffer，混匀，进行点样。 16)电泳条件：120v，40 min；电泳完成后，胶块通过凝胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照记录。 五、实验结果 观察并分析电泳图片 六、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。 实验二 质粒DNA的片断化及分离 一、实验目的 1、学习利用紫外分光光度法鉴定DNA质量 2、采用Ⅱ型限制性核酸内切酶切割质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切效果。 二、实验原理 DNA吸收光谱峰在260 nm处，测定此波长下DNA溶液的OD值，当