植物材料蛋样品制备和应用实例.docVIP

植物样品制备方法（TCA-丙酮沉淀法） 植物样品多含有酚类色素等杂质，故多使用TCA-有机溶剂沉淀法去除酚类色素等杂质，以利于蛋白的抽提。需要注意的是TCA有利于去除酚类色素等杂质，但不利于蛋白的抽提，使用浓度不宜过高，在使用蛋白提取液抽提蛋白之前应尽量除去。 1.需要制备的植物样品置于液氮中冷却，并且将10%的TCA-丙酮溶液和丙酮置于-20℃冰箱中进行预冷； 2.在干净的研钵中加入液氮进行预冷，样品于液氮中进行研磨，重复加液氮研磨至粉末状； 3.取出磨好的样品用10倍（质量体积比）10%的TCA-丙酮溶液悬浮，加入终浓度 为1 mM PMSF、2 mM EDTA、10 mM DTT，超声1分钟，于-20℃冰箱静置2小时（或过夜） 后，4℃，35,000g，15分钟离心，弃上清； 4.沉淀用样品10倍体积的丙酮重悬浮，加入终浓度为1 mM PMSF、2 mM EDTA、10 mM DTT，于-20℃下静置2小时后，4℃，35,000g，15分钟离心，弃上清； 5.重复步骤4两次； 6.取出沉淀真空干燥约5分钟，除尽有机溶剂； 7.按10 mg样品干粉末加200 ul蛋白抽提液（不同样品存在差异，常用的为8 M 尿素、4% CHAPS、0.5-2% 两性电解质（PH 3–10）、40 mM Tris base pH 8.5）的比例，加入1 mM PMSF、2 mM EDTA、10