北醫分子生物学复习思考题.docVIP

如何设计DNA序列的引物（尤其为方向） （1）引物长度以15~30个bp为宜。引物过短会使特异性降低， 过长时则成本增加，且也会降低特异性。 （2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶堆积现象， 引物G+C含量宜在45~55%左右。 （3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3‘末端不应 有互补链存在。 （4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。要求在引物设计时 进行辅助检索分析。 （5）引物3‘末端碱基：原则上要求引物3’末端与模板DNA一定要配对。另外引物3‘末端的末位碱基在很大程度上影响着Taq DNA聚合酶 的延伸效率。研究表明，引物3‘末端碱基在错误配对时，不同碱基的引发效率存在很大差异。当末位碱基为A时，即使在错配的情 况下，也能引发链的合成。而末位碱基为T时，错配时引发效率 大大降低。G,C居于中间，所以3‘末端的末位碱基最好选T,G,C而不选A. (6) 引物5‘末端碱基：PCR反应物5’末端碱基并没有严格限制， 只要与 模板DNA结合的引物程度足够，其5‘末端碱基可以不 与模板DNA匹配，而呈游离状态。这样引物设计时可以在5‘末端加上限制性内切酶位点或其他短的序列。可以加ATG起始密码，可以加错配碱基造成突变。 二、提高PCR 扩增特异性1. 递减PCR（TouchDown PCR） 递减PCR 通过在PCR 的前几个循环使用严紧的退火条件