第3章生物制片技术.pptVIP

第三章 制片技术 一、概念: 生物制片技术是动物学、植物学、细胞学、组织胚胎学、病理解剖学等生物科学及医学科学研究观察组织细胞的生理、病理形态变化的一种重要方法。 二 、分类：生物制片法可分 为切片法和非切片法两种类型。 切片法就是将新鲜的材料经过特殊的处理，用刀切 成薄片的过程。 主要有徒手、石蜡、冰冻、火棉胶切片法等。 非切片法是用物理或化学的 方法，将生物体 组织分离成单全细胞或薄片，或将整个生物体进行封藏。 常用的非切 片法有整体装片法、压片法、滴片法、解离法、伸展法等。 石腊切片的流程 第一节 石蜡切片法制片技术 一、取材和固定： (一）取材：新鲜，材料大小、部位因观察的对象不同而有所差异。 (二)固定：将所要观察的新鲜材料立即投入固定剂内，借助化学药品的作用，使组织细胞的形态结构保存起来，不使其形态和内部物质改变的一种方法。 固定的作用主要是防止组织溶解和腐败、凝固沉淀细胞内的物质同时又使组织硬化，增加组织硬度，使组织细胞不易变形，有利于以后的处理。 理想固定剂必需具备几个条件 1、迅速渗入组织，杀死原生质，固定其微细结构。 2、使细胞不至于因固定引起人为的改变。 3、凝固原生质后，增加细胞对各种穿透的抵抗力，不至于因以后的处理而使固定了的原生质变形。 4、不会改变原生质的体积。 5、增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别。 6、具有媒染作用和增加染色能力。 7、使组织变硬，适于切片，但又不至于使 材料太坚硬而松脆。 8、固定以后，又能有保存的作用。 固定过程中的一些要求 1、充足：固定液一般为材料块的20--30倍，有些水分过 多的材料，中间还要更换1--2次新液。 2、时间：视材料的种类、性质、大小以及固定剂的种类，性质、渗透力的强弱而定。 3、 PH值：PH值较大的固定液，可增强染色能力。许多酸性固定液可溶解核质 和线粒体，但能保存染色体、核仁和 纺缍丝；而一些碱性固定液 能溶解某些材料的染色质和纺缍丝，但核仁、线 粒体可被保存。固定剂应以所观察的内容和染色剂而定。 固定液的类型 单一固定液： 1、乙醇：组织保存剂，制片时的 固定剂。50%以上的乙醇都有固定作用。 酒精固定的特点是杀死快,渗透力强，可使材料变硬。用纯酒精固定时间不宜太长，否则会使材料发脆，但70%的酒精可较久的保存材料。 酒精可凝固蛋白质，但不能沉淀核蛋白，不适合固定染色质。 酒精能溶解类脂物，不能固定高尔基体和线粒体。 酒精是还原剂，能被氧化为醋酸，一般不与铬酸、锇酸和 重铬酸钾等氧化剂配合为固定液。 酒精与福尔马林、醋酸混合使用则效果更佳。 2、福尔马林： 市售的福尔马林约含37%---40%甲醛，单独使用时，浓度在2%---10%左右，为很好的硬化剂，但渗透力不强。 不能使白蛋白和核蛋白凝固，但能保存类脂物，可用作高尔基体及线粒体的固定。 用福尔马林固定的材料，有利于核的染色，特别是用动物组织的固定效果更佳。 还原剂，易被氧化成甲酸，故不宜与氧化 剂铬酸混合使用，但若与酒精混合使用，效果更佳。 3、醋酸 醋酸 又称乙酸，常在16、7℃以下凝成冰状固体 故名冰醋 酸 。 用 0.3%---5%的醋酸作固定液，渗透力极强，对 一般组织短时间内就可产生固定作用。 醋酸可沉淀核蛋白，所以对染色质或染色体的固定 和染色都很好，但它不能固定类脂物。 醋酸可使细胞膨胀和防止收缩；同时由于它不能凝固细胞质中的蛋白质 ，组织不会硬化 ，因此可与引起组织收缩的液体相混合，起到相互平衡的作用。 4、苦味酸(三硝基苯酚） 苦味酸是极毒的黄色结晶，极易爆炸，常配成饱和水溶液贮存，它在水中的溶解度为0.9%---1.2%，亦可溶于酒精、氯仿等。 可沉淀一切蛋白质，对类脂物无作用，也不能固定碳水化合物。渗透速度较慢。固定后细胞收缩明显，收缩率达50%以上，但不使组织硬化. 苦味酸的固定时间不宜过 长，否则会影响苏木精等碱性染料的染色。 苦味酸固定组织的黄色，在以70%酒精脱水时加入少许碳酸锂饱和水溶液即可除去。 5、升汞（氯化汞） 是一种毒性很强的化合物，渗透力仅比醋酸弱. 几乎可沉淀所有蛋白质，升汞能充分固定细胞质和细胞核，并可增加对酸 性 染料的亲和力，升汞能使组织收缩，但硬化作用不强，多与冰醋酸、铬酸盐及甲醛混合使 用。 升汞固定的材料中常存有沉 淀或结晶，因此固定后用 0.5%的碘酒（70%酒精）洗涤，以提出升汞；然后再用70%酒精洗涤，将碘 去掉；最后还要用0.2%--0.5%硫代硫酸钠溶液洗涤，彻底去掉碘黄色。 6、重铬酸钾 为橙红色结晶，性毒，为一种强氧化剂，不能与酒精、甲醛混合。同时为一种强硬化 剂 ，渗透力差，很少单独使用。 与醋 酸 混合后，ph在4.6时 可以固定染色体 ，以及对细胞质和染色体产 生网状沉 淀作用。在未与醋酸混合p