3基因工程载体1.ppt

2、转化的概念及原理 ： 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。 受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。 Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。 化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。 除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。 原理是以高电压(数千伏 )在很短时间(微秒时间)内脉冲电击细菌细胞，使细胞膜产生许多小孔，质粒DNA通过这些小孔进入菌体而转化。针对不同的菌株，需要优化各种参数，包括电场强度、脉冲长度、脉冲 次数、电极与样品的距离以及细菌和DNA浓度等。更高的电压、更长的脉冲时间虽然能提高转化率，但细菌的存活率降低。 电击（电穿孔）法操作简单，制备用于电击法的细菌比制备感受态 菌容易。细菌生长到对数中期后加以冷却，离心，然后用低盐缓冲液充分清洗以降低细菌悬 液的离子强度,但不必形成原生质体。然后用10%甘油重悬细菌，使其浓度为3×1010细菌／ml，在干冰上速冻后置－70℃贮存。这样，每小份细菌融解后即可用于转化， 其有效期至少为6个月。电穿孔在低温下(0～4℃)进行，如果在室温下操作，转化效率可能 会降低百倍。 3、感受态细胞制备及转化中的影响因素： ⑴、细胞的生长状态和密度 最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。 此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。 ⑵、质粒DNA的质量和浓度 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋状态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。 对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。 ⑶、试剂的质量 所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃。 ⑷、防止杂菌和杂DNA的污染 整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。 ⑸、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。 par序列可以控制细菌细胞内遗传物质的均等分配 * 生殖性质粒又称致育质粒 * 从降解萘的假单胞菌ND6菌株中分离出萘降解质粒pND6-1，测定了该质粒的核苷酸序列为101858bp，注释了该质粒的102个编码序列，这是世界上第一个测