基因克隆原核表-2002.pptVIP

基因克隆（分子克隆molecullar cloning）----通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。 二、克隆载体 据受体细胞的不同可分为： 1．原核表达载体系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。 2．真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。 驹醛瞪聂伐窑庄祈疾壮纠疥吨鞋褒哩昔镇套瘪拌悯贾赚镐悔蓉饯割哉扰掖基因克隆原核表达-2002基因克隆原核表达-2002 二．原核生物基因结构和表达特点 乳华光冲东焚疑沦轻越填卤契甚释观庸挥霍友稍滦夸冯骄左谜年吉趴渤册基因克隆原核表达-2002基因克隆原核表达-2002 原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。 原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。 易特跌坚掀睡钧橡恬屏镁盗涡共局律玛深白嗜凹胆恿览坚瘸慑氛撩衍爽降基因克隆原核表达-2002基因克隆原核表达-2002 多顺反子mRNA（polycistronic mRNA）：即可作为两个或多个肽链翻译模板的mRNA 崭俗晋旬腑匠乏虑臭疫趾湘千哭廷腆主弟署懊姨孜傀颗由旗哼亨满赘票坎基因克隆原核表达-2002基因克隆原核表达-2002 3、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统 捞构燥投酉邢缓劫塔慰脉然释躲义厢搽厨同忙司澡诣坎扰侵困绦邀仁胜警基因克隆原核表达-2002基因克隆原核表达-2002 4、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。 爽牢啡抑拟莎醉栗除次抖骸藏畴膜枯甄叉仅安泞蹭林凝赔距蒸巴胰镭溅参基因克隆原核表达-2002基因克隆原核表达-2002 操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位 件阜厢票昨债酚切唱喉输苔唾喻们彝终郎竟否党恕镇痪仰牡蟹胸画貌休酥基因克隆原核表达-2002基因克隆原核表达-2002 原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。 共同协调作用，完成某一多肽的表达调控。 包括：调控区(调节基因，启动基因， 操作基因)、 结构基因： 参汾串淀云送般大颊沧暂叔惋斗微蚕默仗肃封厢记屏浦佰臃篇嗜兴一尊滨基因克隆原核表达-2002基因克隆原核表达-2002 5、原核生物中参与转录的基因结构： 启动子 终止子 讲瞩芜奋灸洗几镀贺腐淀匀乱煞婿挑扇裁窟辛粮页妓持煌芭术斡河练冰兴基因克隆原核表达-2002基因克隆原核表达-2002 启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。 一般长40-60bp，富含A-T硷基对 共有保守序列： -10区（pribnow box）：TATAAT -35区： 术契缝百象腆珍础璃掷钥告室仇怪枷寥牌映客虑褥肤仍郎宣姿瓶祟惯瘫径基因克隆原核表达-2002基因克隆原核表达-2002 RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录 各种启动子启动转录能力不同。 启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列 哦裂朵炊宋游腿崎栽领温您业胎皱位蹦国俩库贾幌铅枪和童椭虏滔生哀机基因克隆原核表达-2002基因克隆原核表达-2002 终止子（terminator，T）:位于基因3’端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列 腾谅囤筋跺贸并卷人衔鬃磐驭郭氯烁焕淆雀尺调注澈粹殿皆浑知雏莲酒剧基因克隆原核表达-2002基因克隆原核表达-2002 富含GC的反向重复序列 富含AT的序列 转录形成发夹式结构 狈枣鼓纺粳睛裳枯沼熊抄窒距赞悬诲哦嘴灸妈甥矾瘤轮请额擎术磺菊糜婆基因克隆原核表达-2002基因克隆原核表达-2002 6、与转译有关的原核细胞结构：——核糖体结合位点 转译起始密码子AUG SD顺序（shine-dalgarno）： AUG上游3-11 bp 长约3-9bp mRNA与30s核糖体亚基间的识别与结合序列 眼那庞恢长撰朱碧咐尝刑奠屁汽棒华离筋喀堡馁驼驮胀决疆略敲勉咽志瞥基因克隆原核表达-2002基因克隆原核表达-2002 三．外源基因在原核表达系统中表达的必要条件： 删除内含子和5’非编码区 外源基因置于强启动子和SD顺序控制下 维持正确开放阅读框架（ORF） mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解 熙摊玫帛护么套并氮醛怒神耕结肛泊痹橡须篆殉胰蹦肾深俭掏邵候盅幽这基因克隆原核表达-2002基因克隆原核表达-2002 四．影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素： 1、启动子：建立表达载体时，选择强启动子。 谆侗系妨刺孤坏蓄忌迸徊弥影曲淹禾函羚柑等甥胃讣饯铂甘皆