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生命科学与技术学院 仪器分析实验讲义 仪器分析课程组编 2012.6 实验一　荧光分光光度法测定维生素B2 一、实验目的 1、学习荧光分析法的基本原理 2、了解荧光分光光度计的构造，掌握其使用方法。 二、实验原理 在一定波长紫外光的照射下，维生素B2会发出荧光。在PH6－7 的溶液中荧光最强，在PH11 时荧光消失。在低浓度时，溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系。因此，选择荧光峰值波长为测量波长，测量维生素B2 溶液的荧光强度，可对维生素B2进行定量分析。本实验采用标准曲线法来测定维生素B2的含量。 三、仪器与试剂 仪器 960 型荧光分光光度计、比色皿1个、50ml 容量瓶6 个、5.0ml吸量管1 支 试剂 维生素 B2标准溶液、1％醋酸溶液、维生素B2样品溶液 四、实验内容 1、配置标准溶液（实验室准备） （1）维生素B2标准溶液：取维生素B2约10mg，精密称定，置1000ml 容量瓶中，用1％醋酸溶解并稀释至刻度。再精密量取此溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml 分别置50ml 容量瓶中，以1％醋酸稀释至刻度，待测。 （2）维生素B2样品溶液：取维生素B2片20 片，精密称定，计算平均片重。研细混匀后，精密称取2片量的维生素B2片样品粉未，置1000ml 容量瓶中，用1％醋酸溶解并稀释至刻度。滤过。精密取续滤液2ml, 置50ml 容量瓶中，以1％醋酸稀释至刻度。待测。 2、测定 （1）扫描图谱：选择EM=200－700nm，lEX=365nm(固定波长)对空白和维生素B2标准溶液进行扫描，找出荧光峰值处对应的lEMmax。 （2）标准工作曲线的绘制（F-C）：在lEMmax下分别测定上述五种维生素B2标准溶液的荧光强度（INT），然后以浓度（ug/100ml）为横坐标，荧光强度（INT）为纵坐标绘制标准工作曲线。 （3）维生素B2样品溶液中维生素B2的含量测定：将配置好的维生素B2样品溶液置1cm比色皿中，以1％醋酸为空白，在上述波长下测定荧光强度值，从工作曲线上求出维生素B2样品溶液中维生素B2的浓度。 五、数据处理及计算 (1) 标准工作曲线的绘制 编号 1 2 3 4 5 维生素B2标准溶液的浓度 （ug/100ml） 荧光强度（INT） (2)根据样品液的F 值，从工作曲线上求出维生素B2样品溶液中维生素B2的浓度。根据测得结果，求算维生素B2片中维生素B2的含量（mg/片）。 六、思考题 1、荧光法有何优缺点？它的适用范围是什么？ 实验二 气相色谱法测定混合溶剂的含量 一、实验要求 1. 掌握气相色谱分析的基本原理和操作。 2. 掌握色谱条件优化的原则及方法。 3. 学习定量校正因子及归一化法定量分析的基本原理和测定方法。 4. 熟悉色谱工作站的操作。 二、基本原理 气相色谱法是以气体（载气）为流动相的柱色谱分离技术。其原理是利用被分离分析的物质(组分)在色谱柱中的气相(载气)和固定(液)相之间分配系数的差异，在两相作相对运动时，在两相间作反复多次(103～106次)的分配，使得原来的微小差别变大，从而使各组分达到分离的目的。根据色谱图进行组分的定量时，所用定量方法主要有归一化法、内标法和外标法三种。 把所有出峰组分的含量之和按100%计的定量方法称为归一化法。归一化法的优点是计算简便，定量结果与进样量无关，且操作条件不需严格控制，是常用的一种色谱定量方法，当各组分色谱峰宽窄比较悬殊情况下，采用此法较为准确。该法的缺点是试样中所有组分都必须分离流出，并且得到可测量的信号，其校正因子也均为已知。为了消除色谱条件对响应值勤的影响，在色谱定量分析中通常采用相对校正因子f’i即被测物质i与标准物质s的绝对质量校正因子之比值： f’i= fi / fs = (mi / Ai) / (ms / As) = miAs / msAi 使用归一化法定量，要求试样中的所有组分都能得到完全分离，并且在色谱图上都能出峰，计算式为： mi% = fiAi/∑fiAi×100 本实验通过测量混合烃试样中各组分的峰面积，利用相对校正因子，用归一化法计算出各组分百分含量。 三、仪器和试剂 1. 仪器：GC-4002型气相色谱仪；氢焰离子化检测器（FID）；OV-101弹性石英毛细管色谱柱（30m×0.32mm×0.5μm，非极性柱）；1μL微量进样器；载气为氮气。 2．试剂和样品：甲苯（沸点110.6℃）、正丁醇（沸点117.7℃）、环己烷（沸点80.7℃）、二氯甲烷（沸点39.8℃），均为分析纯。待测样品为含以上4种试剂的含量未知的混合液。 四、色谱条件 1. 汽化温度：130℃； 2. 柱温：60℃； 3. 检测器温度：13