分子生物学讲义（TBHBVHCV）20120227.pptVIP

* 一、HCV核酸检测 2.2方法 RNA→cDNA→PCR 直接RNA扩增（NASBA） 实时荧光定量 * 一、HCV核酸检测 3.基因分型 3.1临床意义 中国亚型1b(66%)和2a(14%)对抗病毒治疗应答不同使治疗方案不同 * 一、HCV核酸检测 3.2方法 测序 LiPA（可分5-10%混合型，贵） PCR-RFLP 不足，分型可，亚型区分尚待进步 * HCV 5’UTR gene Second PCR product=257bp Scheme A Cleavage with BsrBⅠ,HinfⅠand HaeⅡ 93 and 91bp Genotype 2a and 2b 257bp Genotype 3b,4a and 5a 127 and 91bp 104,74bp 160,74bp 2a 2b 160,74bp 234bp 3b 4a and 5a Cleavage with HaeⅢ Scheme C Cleavage with ApoⅠ 183,74bp 257bp 4a 1b 197bp Genotype 1a, 1b and 6a 166/169 and 91bp Cleavage with BstUⅠ Scheme B 1a 227bp 5a Genotype 3a 6a 257bp HCV 5’非编码区ABC程序复合酶切分型法流程图 -北京大学人民医院肝病研究所提供 * 一、HCV核酸检测 4.HCV基因耐药突变 特异基因靶向治疗（小分子抑制物）中靶点编码区的耐药 HCV蛋白酶(NS3-4A) RNA酶(NS5b) 丙肝实验室诊断小结 抗 HCV HCV—RNA(或HCVAg) 解释 阴性 阴性 排除HCV感染 阳性 阳性 活动性HCV感染（急性或慢性感染） 阴性 阳性 早期HCV感染 免疫障碍患者慢性HCV感染 阳性 阴性 康复 低或间歇病毒血症慢性感染 抗——HCV假阳性结果 “被动”输入抗体 * 肝炎核酸检测小结 1.临床广泛应用、仍在发展中 2.自动化：前处理 3.标准化： WHO 2代HBV标准品 3代HCV标准品 * HIV病毒模式图 HIV病毒颗粒由基因组RNA、外膜蛋白Env、 衣壳蛋白Gag、逆转录酶RT，蛋白酶PRO及整合酶IN组成 * HIV筛查实验： 2~12周；窗口期 HIV确证实验（confirm） WB；HIV感染确证 检测HIV /AIDS 患者的 CD4 T 细胞计数和 HIV 病毒载量，以监测病情，确定开始抗 病毒治疗的时间，评价抗病毒治疗的效果。 在抗病毒治疗时亦进行HIV 基因型耐药检测。 HIV检测的主要实验 * * 《全国艾滋病检测技术规范》（2009年修订版） 第一章 样品的采集和处理 第二章 HIV抗体检测 第三章 HIV-1抗原检测 第四章 HIV核酸检测 第五章 HIV-1耐药检测 第六章 CD4+和CD8+T淋巴细胞检测 第七章 HIV-1的分离培养 第八章 实验室生物安全 第九章 艾滋病检测实验室质量管理 * 靶序列来源: a. 单抗检出的TB抗原蛋白编码基因 b. TB特异性核酸片段克隆 c. 插入序列 结核分枝杆菌(TB) 的分子诊断TB 检测 实验设计特点 * ? 标本处理 ：痰液化，抑制物去除 ? 试剂质控及灵敏度 注意事项 结核分枝杆菌(TB) 的分子诊断TB 检测 * 结核的PCR临床主要应用 a.结核与其他分枝杆菌区分 b.结核耐药基因 c.对含菌量低的标本的分离 d.为临床可疑者捕捉信息 临床评价 结核分枝杆菌(TB) 的分子诊断TB 检测 * ? PCR方法与痰涂片及TB培养的比较 应做比对研究 临床评价 结核分枝杆菌(TB) 的分子诊断TB 检测 * RFP（利福平） INH（异烟肼） SM（链霉素） EMB（乙胺丁醇） PZA（吡嗪酰胺） 喹诺酮类 已确定的耐药的抗结核药物 结核分枝杆菌(TB) 的分子诊断耐药监测 * 单耐药基因检测 耐利福平： 突变一般发生在RNA聚合酶B亚单位编码基因（rpoB基因） 突变位点：531位 丝氨酸?亮氨酸 526位 组氨酸?酪氨酸 突变导致RFP 不能与RNA聚合酶B亚单