荧光定量PCR技术原理与结果分析分解.pptVIP

荧光定量PCR技术原理与结果分析 罗喜鹏 一、含义 二、优越性 三、应用 四、定量方法 五、荧光材料 六、结果分析 一、含义 实时荧光定量PCR技术(Real-Time Quantitative PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 二、优越性 特异性 荧光定量PCR具有引物和探针的双重特异性，故与传统的PCR相比，特异性大为提高。 敏感性 荧光定量PCR的敏感度通常达E2拷贝/ml，对数期分析，线性范围很宽，为0-E11拷贝/ml。一般来讲临床标本中病原体的数目为0-E10/拷贝，在此范围内荧光定量PCR定量较为准确，标本不需稀释。 重复性 荧光定量PCR结果相当稳定，因为域值设置在指数扩增期.在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用，CT与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比CT值能更稳定，更精确地反映起始模板的拷贝数。 自动化 无PCR后续操作步骤，降低产物污染的风险性。 三、应用 用于核酸的定量如RNA、DNA的定量 用于核酸定性分析如SNP分析，基因型分析，RNA变异分析，溶解曲线分析等。 四、定量方法 1.?? 标准曲线法的绝对定量 2.?? 标准曲线法的相对定量? 3.?? 比较CT法的相对定量 五、荧光材料 荧光探针和荧光染料 ◇ ?