第五章+++目的基因的克隆.pptVIP

A 鸟枪法 B 基因文库的构建 D PCR法 E 化学合成法 转座子 转座子（DNA-DNA方式转座的转座子 ） 逆转座子（retrotransposon ） 自主转座元件 非自主转座元件 转座子可以通过DNA复制或直接切除两种方式获得可移片段，重新插入基因组DNA中。自主转座元件本身能够编码转座酶而进行转座，非自主转座元件则需在自主元件存在时方可转座，以玉米的Ac/Ds体系为例，Ac(Activator)属于自主元件，Ds(Dissociation)则是非自主元件，必需在Ac元件存在下才能转座 逆转座子又称为返座元(retroposon)，是近年新发现的由RNA介导转座的转座元件，在结构和复制上与反转录病毒(retrovirus)类似，只是没有病毒感染必须的env基因，它通过转录合成mRNA,再逆转录合成新的元件整合到基因组中完成转座，每转座1次拷贝数就会增加1份，因此它是目前所知高等植物中数量最大的一类可活动遗传成分。 目前共发现了3种类型反转录转座子：Tyl-copia类，Ty3-gypsy类和LINE(long interspersed nuclear Clements)类转座子，前两类是具有长末端重复的转座子，LINE类转座子没有长末端重复。高等植物中的反转录转座子主要属于Tyl-copia类，分布十分广泛，几乎覆盖了所有高等植物种类 克隆转座子主要有两条途径： 根据序列同源性，在基因组的不同位置分离同一家族的转座子成员 利用抗体识别或cDNA探针从野生型植株中获得表达量降低或不稳定基因座的序列，再从突变体中分离得到相应的转座子 反转录转座子 水稻 Tos17 Ⅰ类自主型转座子 拟南芥 dTphl Ⅰ类自主型转座子 金鱼草 Tam Ⅰ类自主型转座子 玉米 Spm/En Ⅰ类自主型转座子 玉米 Mu(Mutator) Ⅰ类非自主型转座子 玉米 Ds(Dissociation) Ⅰ类自主型转座子 玉米 Ac(Activator) 类 型 来 源 名 称 Ac-Ds系统： Ac： 4565 bp 末端反向重复序列（11 bp） 自主元件 转座酶基因 Ds： Ac的缺失序列，结构多样 末端反向重复序列（6~13） 非自主元件 反向重复序列 转座酶 足迹 T-DNA标签法（ T-DNA tagging） 差示分析法分离目的基因 mRNA差别显示技术（mRNA differential display by PCR, DD-PCR ） 代表性差别分析技术（representation difference analysis, RDA ） 抑制性减法杂交（suppression subtractive hybridization, SSH ） mRNA差别显示技术 mRNA差别显示技术：或称为差别显示反转录PCR（ differential display reverse transcription PCR, DDRT-PCR ） P.Liang and A.D.Pardee found in 1922 mRNA差别显示技术：是通过对某一特定细胞类型或发育阶段表达的mRNA与另一细胞类型或发育阶段表达的mRNA进行RT－PCR扩增，并利用电泳和放射性自显影技术来对不同细胞类型或发育阶段进行对比显示差异，进而寻找不同细胞类型或发育阶段代表性的基因基因克隆方法 mRNA差别显示技术的基本原理 绝大多数真核生物mRNA（除极少数特例，如组蛋白基因）都有polyA尾巴，在polyA尾巴前（5′上游）的两个碱基，除第二为的情况之外，只有12种可能 将这12种序列的互补序列作为下游引物，反转录mRNA，合成第一链cDNA。这种引物通常叫锚定引物 通式 5′T11MN或5′T12MN M：A、G、C N：A、T、G、C 这12个锚定引物中的每一条引物都可扩增出某一特定细胞的总cDNA的1/12，由此可将整个mRNA在cDNA水平上，分成大致相等的但序列不同的12份亚群体。这些群体中，代表某一特定细胞类型或发育阶段的mRNA种的含量是相当低的。 要分离在某一特定细胞类型或发育阶段表达的mRNA、而在另一细胞类型或发育阶段不表达或表达量不同的基因，就要进行PCR扩增 引物 上游引物：3′端的12种锚定引物 下游引物：5′端20种10mer随机引物(arbitrary primer, AP) 引物对组合240对 在