第六章目的基因的克隆及基因文库的构建.pptVIP

64 （1）利用PCR技术构建cDNA文库 能够从极其有限的起始材料中构建cDNA文库。 以总RNA为模板合成cDNA，无需mRNA的纯化，不仅简化操作，而且避免了低丰度信息分子的丢失。 能够提高cDNA文库的完整性，获得那些低水平表达的基因的cDNA克隆。此法对植物基因功能的研究，如对某种外界因素作用后或不同发育阶段基因表达变化的研究尤为适用。 65 （2）应用差别杂交法构建cDNA文库 适用于分离经特殊处理而被诱发表达的cDNA克隆； 技术基础：在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达； 可以通过这两种总mRNA（cDNA拷贝）为探针的平行杂交，对有目的基因表达的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。 66 差示筛选（Differential Screening） 67 （3）应用扣除杂交法构建cDNA文库 不是细胞内所有表达基因全体的集合，而是主要含差异表达基因的部分cDNA的集合； 用过量的参照细胞mRNA或cDNA与目的细胞cDNA或mRNA(又称目的序列)杂交，形成的RNA-cDNA杂交体是两种细胞共有的，将其扣除；剩下的cDNA或mRNA可以标记成探针(称减法或扣除探针)，从上述目的细胞的cDNA文库中筛选目的克隆； 实质上是除去了一大批高丰度非特异性的cDNA，含有的是特异表达的cDNA克隆及其它一些低丰度mRNA的cDNA克隆。 68 扣除杂交（Subtractive Hybridization） 69 基因组文库 cDNA文库 信息供体 DNA mRNA 载体 噬菌体，黏粒，人工染色体 质粒，噬菌体 连接前 部分酶切，分级分离 反转录合成cDNA双链 连接 粘端连接，人工接头 同聚物加尾，人工接头 筛选 核酸探针 核酸探针，免疫探针 基因组文库和cDNA文库的比较 70 组织 可克隆之DNA 载体 DNA cDNA mRNA 部分酶解DNA DNA长度分级 双链cDNA DNA与载体连接 引入宿主细胞 鉴定文库的完备性 扩增后供长期储存 筛选出所需要的克隆 71 PCR原理图 32 由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的T载体克隆。 2.PCR克隆目的基因的基本程序 5’ 5’ A A T T 5’ 5’ PCR扩增产物 T 载体 T7 lacZ MCS ori Ampr 33 （五）化学合成法克隆目的基因 随着寡核苷酸化学合成的自动化，基因的化学合成变得更经济、容易和准确。 前提条件：对基因的结构序列清楚 。 分为：基因片段的全化学合成 基因的化学-酶促合成 34 1.化学合成法的基本策略 （1）全基因合成 化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种策略。 ①小片段粘接法： 混合退火 根据目的基因全序列，分别合成12-15个碱基的单链DNA小片段 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体 35 ②补丁延长法： 混合退火 根据目的基因两条互补链的全序列，分别合成12-15个碱基的单链DNA小片段以及20-30个碱基的单链DNA中片段 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体 Klenow酶聚合 36 ③大片段酶促法： 混合退火 根据目的基因的全序列，分别合成40-50个碱基的单链DNA片段 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体 Klenow酶聚合 37 上述三种方法各有利弊： 化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高； 在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低。例如，每聚合一个单体的产物收率为95%，则合成50个碱基的DNA单链大片段的总收率只有7.7%。 38 （2）探针等寡聚核苷酸合成 在某些情况下，往往