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蛋白质化学 蛋白质的层析分离 根据物质在固定相和流动相中的分配系数的不同，使分配系数只有微小差异的物质获得最大的分离效果。 根据两相状态，分为： 气相层析和固相层析 根据层析机理，分为： 吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析 层析法的一般原理 溶质在两个互不相溶的溶剂中，它在固定相和流动相中的浓度比是一个常数，称为分配系数，这就是分配定律： 或用溶质在两相中的体积表示： 塔板理论 柱子的分离效率在一定条件下主要决定于塔板数的多少,柱子的塔板数主要依赖于柱长和理论塔板高度: N=L/H=16(Ve/W)2 H:理论塔板高度 Ve: 洗脱体积 W:峰宽 D值一定的条件下,提高柱效: (1)增加柱长 (2)降低理论塔板:降低流速和支持物的颗粒度 离子交换层析 原理:根据蛋白质分子所带电荷的不同来达到分离的目的. 经化学反应将解离集团引入到惰性支持物上,通过不同的电荷来分离分子。 解离离子带负电， 结合阳离子，称为阳离子交换柱。 带正电， 结合阴离子，称为阴离子交换柱。 注: pH在等电点处,分子的净电荷为0,无相互作用; pH在等电点以上,分子带负电,可结合于阴离子交换剂; pH低于等电点,分子带正电,可结合于阳离子交换剂. 离子交换层析 平衡:电荷量越大,结合越牢,在柱中移动速度越慢;电荷不同,亲和力不同. 洗脱:带电蛋白质分子与交换剂的结合可逆. 通常,用盐梯度和pH梯度可把吸附的蛋白质从柱上洗脱下来. 离子交换剂的基本类型 离子交换的支持物 纤维素 具有松散的亲水性网络,较大的的表面积、吸附容量大，通透性好。 葡聚糖凝胶(Sephadex) 既有离子交换剂的性质，又有分子筛效应。 琼脂糖凝胶(Sepharose) 吸附容量大，能维持交好的流速和分辨率。Fast flow的Sepharose。 层析条件的选择 了解样品的性质：稳定性、不同pH下的带电情况、pH和盐浓度对活性或溶解度的影响。 选择正确的离子交换剂。 电荷、大小 选择正确的缓冲液 合适的pH值; 不能干扰洗脱液的测定。用紫外吸收法测定蛋白质时，不能用带苯环的缓冲离子；在215~225 nm范围测定肽键含量时，不能用带羧基的缓冲液。 阳离子交换用阴离子型缓冲液：磷酸、醋酸等； 阴离子交换用阳离子型缓冲液：Tris-HCl等。 柱层析技术 柱床体积至少要比结合所有样品所需要的要大2~5倍。 层析柱应用起始缓冲液充分平衡。 样品应溶在与起始缓冲液具有相同的pH和离子强度。 要求高分辨率时，上样量不能时紧密的区带超过床体积的5%。 洗脱可以用改变盐浓度或者改变pH来完成。具体实现可分为梯度洗脱与阶段洗脱。 掌握洗脱速度。太快可能降低分辨率；太慢，洗脱峰会扩散。 离子交换剂的再生 层析一般步骤： 处理介质 ↓ 装柱 ↓ 平衡 ↓ 上样 ↓ 洗涤 ↓ 洗脱 ↓ 介质再生 离子交换层析过程图 离子交换层析过程图 习题 三个氨基酸（Leu,Asp,Lys）的混合物，经过一个sulphonoted polysturene 阳离子交换树脂粒，用pH5的缓冲液洗脱，洗脱液中氨基酸出现的顺序是 A．Asp,Leu,Lys; B．Leu,Asp,Lys; C．Lys,Leu,Asp; D．Leu,Lys,Asp 习题 今有以下4种蛋白质的混合物：（1）pI=10；（2）pI=4；（3）pI=8.6；（4）pI=5. 若不考虑其它因素，当它们流过DEAE-纤维素阴离子交换柱，用线性盐梯度洗脱时,这些蛋白质的洗脱顺序如何，并具体说明其原因。 答案:在离子交换柱上，带更多负电的吸附能力更强。四种蛋白质PI值的顺序为1342。因此，在某种pH值下，所带电荷由正到负的顺序为1342。因此，洗脱出现的先后顺序就是1342。 凝胶过滤层析 原理:根据分子量的大小不同而达到分离的目的。载体是一种多孔的凝胶。分子直径比凝胶孔径大的分子,不能进入凝胶颗粒的微孔中。其他分子由大到小先后从凝胶中流出。 凝胶层析支持物的性质。 惰性凝胶介质，不与溶质发生反应。 所带电荷低。 凝胶颗粒的孔径与大小要均匀。 凝胶颗粒与孔度大小的选择范围要宽，能适应不同大小分子的分离。 机械强度高。 常用的有交联葡聚糖Sephadex, Superdex等。 交联葡聚糖的物理性质 凝胶过滤测定样品分子量(1