第五章第三节——五电泳分离.pptVIP

mCl- · aCl- ＞ m蛋- · a蛋- ＞ mGly- · aGly- 1. 浓缩效应 Cl-：快离子；Gly-：慢离子 电泳进行时，在快离子后面形成一离子浓度低的区域，该区域为低电导区。 电导强度与电导成反比，因此，在低电导区产生较高的电场强度。在快离子和慢离子之间形成一个迅速移动的界面。 样品蛋白质聚集在这个移动界面的附近，浓缩为一个狭窄的中间层（浓缩300多倍）。 * 2.分子筛效应 移动界面到达浓缩胶和分离胶界面时，凝胶的pH变化明显，缓冲液中甘氨酸的解离迅速增加，迁移率超过蛋白质分子，随之高电场强度消失。当蛋白质分子量和构型不同时，通过分离胶所受到的阻滞程度不同，导致泳动率不同，结果依据分子量的大小而分开。 * 3.电荷效应 蛋白质所带电荷不同，泳动率也不同，故在同一电场强度中，单位时间内各分子迁移的距离存在差异。因此，蛋白质样品经分离胶电泳后，若样品组分的分子量相同，则它们将按电荷顺序排列，从而导致分离。 * （二) 操作 垂直柱状、板状的不连续凝胶电泳系统 组成和配制 样品的准备 加样 电泳 检测 * 1. 不连续凝胶电泳系统的组成和配制 * （1）缓冲液系统 浓缩凝胶缓冲液 0.5mol/L Tris-HCl,pH6.7 分离凝胶缓冲液 1.5mol/L Tris-HCl,pH8.9 电极缓冲液系统 0.025mol/L Tris（三羟甲基氨基甲烷） 0.2mol/Gly (甘氨酸) pH8.3 样品缓冲液 0.1mol/L Tris-HCl，pH 6.7, 40%甘油、0.05mg/ml溴酚蓝 PH 8.3 PH 6.7 PH 8.9 PH 8.3 * （2）不连续电泳浓缩胶和分离胶的配方 贮存液 凝胶终浓度T 4% 7.5% 10% 15% 20% 单体贮液（14.55:0.55） 0.65 3.8 5.0 7.5 10 浓缩胶缓冲液(ml) 0.1 0 0 0 0 分离胶缓冲液(ml) 0 0.3 0.3 0.3 0.3 dd H2O(ml) 4.25 10.9 9.7 7.2 4.7 真空抽气 10%AP(过硫酸铵) (ul) 5 15 15 15 15 TEMED四甲基乙二胺(ul) 2.5 7 7 7 7 总体积 ~5ml ~15ml * 2. 样品的准备 样品缓冲液与浓缩胶缓冲液pH相同。 样品缓冲液中可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。 样品缓冲液中通常加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。 标准蛋白质样品：是一组（5～7种）已知分子量范围的、构型相近的一套蛋白质，溶解在样品缓冲液中备用。 * 3. 加样要求 加样量一般10～20μl。 用微量注射器距槽底三分之一处进样。注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,以免样品下沉时会发生扩散。 为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样。 * 浓缩胶制备完毕，不宜储存，应立即电泳。 对垂直板凝胶，电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当样品进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。 4. 电泳 * 荧光探针 考马斯亮蓝 氨 基 黑 染色 银 染 色 过碘酸-Schiff试剂 阿尔辛蓝 5. 检测 * 三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） * 在蛋白质样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，分子被解聚成多肽链，它们与SDS充分结合形成带负电荷的SDS－蛋